מֵידָע

1.7: חקירות מדעיות לא ניסיוניות - ביולוגיה


עלה בעשן

סביר להניח שראית את תווית האזהרה הזו עשרות פעמים. זה נדרש על אריזות סיגריות בארה"ב מאז 1965, שנה לאחר שהמנתח הכללי האמריקאי פרסם לראשונה דו"ח הקושר עישון סיגריות למחלות כמו סרטן ריאות. הדו"ח התבסס על אלפי מאמרים מחקריים, כולל תוצאות מחקר חשובות שפרסמו מדענים בריטים ריצ'רד דול ואוסטין ברדפורד היל. החל משנת 1950 ערכו דול והיל מחקרי תצפית רחבי היקף ארוכי טווח בנושא עישון וסרטן ריאות והראו מתאם חזק בין השניים.

לימודי תצפית

שאלות רבות בביולוגיה האנושית נחקרות תוך תצפית לעומת מחקרים ניסיוניים. א מחקר תצפיתי מודד מאפיינים במדגם אך אינו מנסה לתמרן משתני עניין. דוגמה פשוטה למחקר תצפיתי היא סקר פוליטי. מדגם של מבוגרים עשוי להישאל בני כמה הם ואיזה משני מועמדים הם מעדיפים. המחקר מספק תמונת מצב בזמן של דעות הבוחרים הפוטנציאליים וכיצד הם שונים לפי גיל המשיב. אם תוצאות המחקר חלות על האוכלוסייה כולה תלויה בעיקר בכמות המדגם גדולה ואקראית.

במה שונה מחקר תצפיתי מניסוי - תקן הזהב של מחקרי מחקר מדעיים? ההבדל העיקרי הוא איך מטפלים בנבדקים. במחקר תצפיתי, לא נעשה ניסיון להשפיע על הנבדקים בשום צורה. בניסוי, לעומת זאת, החוקר מיישם טיפול על קבוצת נבדקים ומנסה לבודד את השפעות הטיפול על משתנה תוצאה על ידי השוואת קבוצת הניסוי עם קבוצת ביקורת. לדוגמה, בשנת 1954, ג'ונאס סאלק ניסוי ניסיוני של חיסון הפוליו החדש שלו שהתגלה על ידי מסירתו למדגם גדול מאוד של ילדים. ילדים בקבוצת ביקורת לא פחות גדולה קיבלו זריקה בלתי מזיקה של תמיסת מלח אך לא קיבלו חיסון. לאחר מכן השווה סאלק את שתי קבוצות הילדים וקבע כי החיסון יעיל בין 80 ל -90 אחוזים במניעת פוליו.

סוגי מחקרי תצפית

ישנם שלושה סוגים שונים של מחקרים תצפיתיים: חתך רוחב, מקרי בקרה ומחקרי קבוצה. לכל שלושת הסוגים יתרונות וחסרונות.

מחקרי חתך

א חתך רוחב לימוד הוא סוג של מחקר תצפיתי שאוסף נתונים ממדגם של נבדקים רק פעם אחת בנקודת זמן מסוימת. הסקר הפוליטי שתואר לעיל הוא דוגמה פשוטה למחקר חתך. קשר אפשרי בין עישון לסרטן ריאות הוצע לראשונה גם על ידי מחקרים חתכים. חוקרים מצאו שיעור גבוה יותר של סרטן ריאות בקרב אנשים שעישנו מאשר אצל אלה שלא עישנו בזמן המחקר. במילים אחרות, נראה כי שני המשתנים קשורים זה לזה.

מחקרי חתך זולים וקלים לביצוע יחסית, אך תוצאותיהם חלשות, ולכן הם משמשים לעתים רחוקות לבד. לעתים קרובות יותר, חוקר משתמש במחקר חתך כדי למצוא משתנים שעשויים להיות מקושרים ואז מבצע מחקר בקרת מקרה או עוקבה כדי לחקור עוד קשר אפשרי בין שני המשתנים.

מחקרי בקרת מקרים

א מחקר בקרת מקרה הוא סוג של מחקר תצפיתי המשווה בין קבוצת נבדקים בעלי תכונה מעניינת (מקרים) לבין קבוצת נבדקים דומים שאין להם את התכונה (פקדים). סוג מחקר זה הוא בדיעבד. הנבדקים מתבקשים לדווח על התנהגויותיהם בעבר בניסיון למצוא מתאמים בין התנהגויות עבר ספציפיות לבין המצב הנוכחי. האופי הרטרוספקטיבי של מחקרי בקרת מקרה הוא חולשתם העיקרית. תגובות הנבדקים עלולות להיות לא מדויקות מכיוון שהן שוכחות או לא כנותות בהרגלי העבר.

דוגמה קלאסית למחקר בקרת מקרים היא המחקר המוקדם על עישון וסרטן ריאות שבוצעו על ידי Doll and Hill (איור ( PageIndex {2} )). בשנת 1950 ראיינו שני המדענים 700 חולי סרטן ריאה (מקרים) ו -700 אנשים ללא סרטן ריאות (פקדים). הם אספו מידע על הרגלי עישון בעבר ומאפיינים אחרים של אנשים משתי הקבוצות. כאשר השוו בין שתי הקבוצות, הם מצאו קשר הדוק בין התנהגות עישון בעבר לבין המצב הנוכחי של סרטן הריאות.

לימודי קבוצה

א מחקר עוקבה הוא מחקר תצפיתי בו נבחרת קבוצת נבדקים דומים (המחזור) בתחילת המחקר ולאחר מכן עוקבת אחר הזמן. לימוד מסוג זה הוא פוטנציאלי. החוקרים אוספים נתונים על המחזור מעת לעת במשך חודשים ואף שנים לתוך העתיד. מכיוון שהחוקרים אוספים את המידע ישירות, סביר שהנתונים יהיו מדויקים יותר מאשר נתוני הזכירה המדווחים על עצמם במחקרי בקרת מקרה. נתונים פרוספקטיביים מאפשרים גם לחוקרים לקבוע את רצף התקדמות מצבי המחלה או תנאים מעניינים אחרים. מצד שני, מחקרי עוקבה הם מחקרי התצפית היקרים והקשים ביותר לביצוע.

אחד ממחקרי הקוהורט הגדולים ביותר שנערכו נערכו על ידי דול והיל בשנת 1951. הוא התבסס על מחקר בקרת המקרה הקודם שלהם וחקר עוד את הקשר בין עישון לסרטן ריאות. המחזור שהחל את המחקר כלל כמעט 50,000 רופאים בריטים, ואחריהם המשיכו החוקרים במהלך 50 השנים הבאות. ממצאים ראשוניים של המחקר דווחו לראשונה בשנת 1954, ולאחר מכן דווחו תוצאות מעודכנות מעת לעת לאחר מכן. הדו"ח האחרון פורסם בשנת 2004, והוא שיקף את 50 שנות המחקר הקודמות. מחקר זה סיפק עדויות חזקות עוד יותר למתאם בין עישון לסרטן ריאות.

מחקרים רבים אחרים, כולל מחקרים ניסיוניים, הראו באופן חד משמעי כי עישון גורם לסרטן ריאות, בין בעיות בריאות רבות אחרות. איור ( PageIndex {3} ) מציג כמה מההשפעות הרעות שמאז הוכח כי הן נגרמות כתוצאה מעישון.

מתאם לעומת סיבה במחקרי תצפית

מחקרי תצפית יכולים בדרך כלל לבסס מתאם אך לאו דווקא סיבתיות. מתאם הוא קשר בין שני משתנים בהם שינוי במשתנה אחד קשור לשינוי במשתנה השני. המתאם עשוי להיות חזק או חלש. זה יכול להיות גם חיובי או שלילי.

  • אם מוצג שיש שני משתנים בעלי מתאם חיובי, שני המשתנים משתנים באותו כיוון. לדוגמה, מחקר תצפיתי עשוי לגלות שיותר עישון נמצא בקורלציה עם סיכון גבוה יותר לסרטן ריאות. במילים אחרות, ככל שהעישון עולה כך גם סרטן הריאות.
  • אם מוצג שיש שני משתנים בעלי קורלציה שלילית, הם משתנים לכיוונים מנוגדים. לדוגמה, מחקר תצפיתי עשוי לגלות שאנשים שמתאמנים יותר נוטים לפתח סרטן ריאות. במילים אחרות, ככל שהפעילות הגוברת גדלה, סרטן הריאות יורד.

אחד ההבדלים העיקריים בין מחקרים תצפיתיים לניסויים הוא סוגיית המתאם לעומת הסיבתיות. מכיוון שמחקרי תצפית אינם שולטים בכל המשתנים, לא ניתן לפרש כל מתאם שהם מראים בין משתנים מכיוון שמשתנה אחד גורם למשנהו. בניסויים, לעומת זאת, כל המשתנים האפשריים נשלטים, מה שהופך את בטוח יותר למסקנה ששינויים במשתנה אחד גורמים לשינויים במשתנה אחר. לרוע המזל, כאשר מדווחים על מחקרים תצפיתיים בתקשורת החדשות, ההבחנה הזו לא נעשית לעתים קרובות. במקום זאת, משתנה המתואם עם אחר במחקר תצפיתי עשוי לדווח באופן שגוי כגורם לשינויים במשתנה השני.

במחקרי תצפית, תמיד יתכן שמשתנה אחר משפיע על שני משתני העניין ומסביר את המתאם. דוגמה לבלבול המתאם והסיבתיות במחקרי תצפית היא המקרה של ההשפעות הבריאותיות של הקפה. מחקרים תצפיתיים מוקדמים רבים על צריכת קפה ובריאות מצאו מתאם חיובי בין שתיית קפה לבין בעיות בריאותיות כגון מחלות לב וסרטן. האם זה אומר ששתיית קפה גורמת לבעיות בריאות אלה? לא בהכרח, אם כי כלי תקשורת דיווחו על מסקנה זו. בחינה מעמיקה יותר של הנושא מגלה כי שתיית קפה קשורה גם לאורח חיים פחות מודע לבריאות. אנשים ששותים קפה נוטים לתרגל התנהגויות אחרות שעלולות להשפיע לרעה על בריאותם, כגון עישון סיגריות או שתיית אלכוהול. מחקרים תצפיתיים גדולים יותר שבהם נלקחו בחשבון הבדלים באורח החיים לא מצאו קשר בין צריכת קפה לבעיות בריאות. למעשה, הם גילו שלצריכת קפה מתונה עשויות להיות כמה יתרונות בריאותיים.

הרציונל למחקרי תצפית

אם מחקרים תצפיתיים אינם יכולים לקבוע סיבתיות, מדוע הם נעשים? מדוע לא כל שאלות המחקר נחקרות בניסוי? ישנן מספר סיבות חשובות לביצוע מחקרי תצפית:

  • מחקר תצפיתי עשוי להיות סוג המחקר היחיד שאפשר לבצע עבור שאלות מחקר מסוימות מכיוון שלא ניתן לבצע ניסויים, לא מעשיים או לא אתיים. לדוגמה, זה יהיה לא מוסרי לעשות ניסוי בנושא עישון ובריאות שבו נבדקים במדגם העישון נחשפים במכוון לעשן טבק ואז נצפים כדי לראות אם הם מפתחים סרטן ריאות.
  • מחקר תצפיתי בדרך כלל זול וקל יותר לביצוע מאשר מחקר ניסיוני.
  • מחקר תצפיתי בדרך כלל יכול ללמוד יותר נושאים ולקבל מערך נתונים גדול יותר ממחקר ניסיוני.

דוגמניות

דרך נוספת לצבור ידע מדעי ללא ניסויים היא באמצעות דוגמנות. א דֶגֶם הוא ייצוג של חלק מהעולם האמיתי. האם אי פעם בנית מכונית דגם או מטוס? מודלים מדעיים הם דבר כזה. הם מייצגים את העולם האמיתי אך הם פשוטים יותר. זו אחת הסיבות לכך שמודלים שימושיים במיוחד לחקר מערכות מורכבות. על ידי לימוד מודל פשוט בהרבה, קל יותר ללמוד כיצד פועלת המערכת האמיתית.

כהשערה, יש להעריך מודל. הוא מוערך על פי קריטריונים כגון עד כמה הוא מייצג את העולם האמיתי, אילו מגבלות יש לו ועד כמה הוא שימושי. התועלת של מודל תלויה עד כמה התחזיות שלו תואמות תצפיות על העולם האמיתי. זכור כי גם כאשר התחזיות של מודל תואמות תצפיות מהעולם האמיתי, זה לא מוכיח שהמודל נכון או שזה המודל היחיד שעובד.

דוגמנות מערכות ביולוגיות

תופעות רבות בביולוגיה מתרחשות כחלק ממערכת מורכבת, בין אם המערכת היא תא, איבר אנושי כגון המוח, או מערכת אקולוגית שלמה. מודלים של מערכות ביולוגיות יכולים לנוע בין דיאגרמות דו-ממדיות פשוטות לסימולציות מחשב מורכבות. איור ( PageIndex {3} ) מתאר מודל של השפעת הניקוטין על תאים במערכת העצבים.

מודלים אורגניזמים

שימוש באורגניזמים אחרים כמודלים של גוף האדם הוא דרך נוספת לשימוש במודלים במחקר הביולוגיה האנושית. א אורגניזם מודל הוא מין לא אנושי הנחקר בהרחבה כדי להבין תופעות ביולוגיות מסוימות. הציפייה היא שתגליות שנעשו באורגניזם המודל יספקו תובנות לגבי פעולתו של האורגניזם האנושי. במחקר של מחלות אנושיות, למשל, אורגניזמים מודליים מאפשרים הבנה טובה יותר של תהליך המחלה ללא סיכון נוסף לפגיעה בבני אדם בפועל. סוג המודל שנבחר צריך להגיב למחלה או לטיפול בה באופן הדומה לפיזיולוגיה האנושית. למרות שהפעילות הביולוגית באורגניזם מודל אינה מבטיחה את אותה השפעה בבני אדם, תרופות רבות, טיפולים ותרופות למחלות אנושיות מפותחות בחלקן בהנחיית אורגניזמים מודליים.

אורגניזמים ששימשו במחקר ביולוגיה אנושית נעים בין חיידקים כגון אי - קולי לפרימטים לא אנושיים כמו שימפנזים. העכבר שריר מוס, בתמונה למטה, הוא אורגניזם מודל נפוץ במחקר רפואי אנושי. לדוגמה, הוא נעשה שימוש נרחב בחקר השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ובעיות בריאות נלוות. למעשה, מודל העכברים של השמנה הנגרמת על ידי דיאטה הפך לאחד הכלים החשובים ביותר להבנת יחסי הגומלין בין דיאטות מערביות עתירות שומן והתפתחות השמנת יתר.

תכונה: מקורות אמינים

אתה עשוי לקבל את רוב החדשות שלך מהאינטרנט. סביר להניח שאתה גם חוקר שאלות אישיות ונושאי עבודות מונחים באינטרנט. שלא כמו המידע בעיתונים וברוב שידורי החדשות בטלוויזיה, המידע באינטרנט אינו מוסדר לאיכות או דיוק. כמעט כל אחד יכול לפרסם כמעט כל מה שהוא רוצה באינטרנט. האחריות היא על המשתמש להעריך את משאבי האינטרנט. איך תדעו אם המשאבים שאתם מוצאים ברשת אמינים? השאלות להלן יעזרו לך להעריך את אמינותן.

  1. איך מצאת את דף האינטרנט? אם רק "חיפשת" בגוגל נושא או שאלה, תוצאות החיפוש עשויות להיות אמינות או לא. סביר יותר שאמינות הם דפי אינטרנט המומלצים על ידי חבר סגל, המצוטטים במקור אקדמי או מקושרים לאתר בעל מוניטין.
  2. מהו הדומיין של האתר? אם כתובת האתר שלה כוללת .edu, היא קשורה למכללה או אוניברסיטה. אם הוא כולל .gov, הוא קשור לממשלה הפדרלית, ואם הוא כולל .org הוא קשור לעמותה. אתרים כאלה הם בדרך כלל מקורות מידע אמינים יותר מאשר אתרי .com, שהם אתרים מסחריים או עסקיים.
  3. מיהו כותב דף האינטרנט? האם המחבר קשור לארגון או מוסד מוכר? האם אישורי המחבר רשומים, והאם הם רלוונטיים למידע בדף? האם מסופקים פרטי הקשר הנוכחיים של המחבר?
  4. האם המידע מהימן? האם מצוטטים מקורות לעובדות ולנתונים? האם מסופקת ביבליוגרפיה? האם נראה כי קיימת הטיה או נקודת מבט מסוימת, או שהמידע נראה הוגן ומאוזן? האם הדף מכיל פרסום שעשוי להשפיע על תוכן המידע הכלול?
  5. האם המידע עדכני? מתי הדף נוצר ועדכן לאחרונה? האם הקישורים בדף הם עדכניים ופונקציונליים?

יישם את העצה הזו הלכה למעשה. עבור לאינטרנט ומצא מספר דפי אינטרנט המספקים מידע בנושא עישון וסרטן ריאות. אילו אתרים לדעתך מספקים את המידע האמין ביותר? למה?

סקירה

  1. הסבר מדוע מחקרים תצפיתיים אינם יכולים לקבוע סיבתיות. תאר דוגמה להמחשת ההסבר שלך.
  2. השווה את שני סוגי המחקרים התצפיתיים שתוארו לעיל.
  3. זהה שלוש סיבות אפשריות לביצוע מחקר תצפיתי.
  4. מדוע נהוג להשתמש במודלים במחקר הביולוגיה האנושית?
  5. תשובות מרובות: איזה סוג של מחקר כולל זיכרון של משתנים שהתרחשו בעבר? איזה סוג כולל התבוננות במשתנים מההתחלה?
    1. מתאם חיובי; מתאם שלילי
    2. מתאם שלילי; מתאם חיובי
    3. רֶטרוֹספֶּקטִיבִי; לְעַתִיד
    4. לְעַתִיד; רֶטרוֹספֶּקטִיבִי
  6. אמת או שקר. מתאם חיובי פירושו שיש יתרונות בריאותיים למשתנה הנחקר.
  7. אמת או שקר. קבוצה היא קבוצת נושאים בגילאים שונים, משקלים, מגדרים ומצבים בריאותיים.
  8. נעשה מחקר על מנת לבדוק האם צריכת סודה משפיעה על התפתחות סוכרת. הנבדקים הם אנשים שאובחנו לאחרונה עם סוכרת בהשוואה לבקרים שאינם חולים בסוכרת. כל הנשאלים נשאלים כמה פעמים בשבוע הם שתו סודה במהלך השנתיים האחרונות. ענה על השאלות הבאות בנוגע לחקירה מדעית זו.
    1. איזה סוג של מחקר תצפיתי זה?
    2. הנבדקים הסובלים מסוכרת "מותאמים" לבקרות, כלומר החוקרים ניסו למזער את ההשפעה של משתנים אחרים מחוץ למשתנה העניין (כלומר צריכת סודה). מה אתה חושב שחלק מהמשתנים האחרים יכולים להיות?
    3. האם אתה חושב שהנתונים לגבי צריכת סודה יהיו מדויקים? למה או למה לא?
    4. כיצד תוכל לשנות את המחקר כדי לקבל נתונים מדויקים יותר האם קיים קשר בין צריכת סודה לסוכרת? הסבר מדוע המחקר החדש שלך יהיה מדויק יותר.
  9. האם אתה חושב שמודלים של הדמיית מחשבים של מערכות ביולוגיות יכולים להיות מדויקים ללא תצפיות או ניסויים על אורגניזמים חיים או רקמות בפועל?
  10. הסבר מדוע חקירות תצפית וניסיוניות הן שימושיות במדע.

גלה עוד

למידע נוסף על פרויקט המוח הכחול על ידי צפייה בהרצאת TED זו.


שיטות כאב קרביים וסומטיים חושפות את Na ו מסלולי nociceptive קרביים בלתי תלויים ב- 1.7

נקודות מפתח: תעלות נתרן בשער מתח ממלאות תפקיד בסיסי בקביעת ההתרגשות העצבית. באופן ספציפי, תת-סוג ערוץ נתרן מחובר מתחו 1.7 נדרש לחישה של כאבים סומטיים חריפים ודלקתיים בעכברים ובבני אדם, אך משמעותו בכאב שמקורו בפצעייה אינה ידועה. באמצעות מודלים התנהגותיים השוואתיים המעוררים מסלולי כאב סומטיים וקרביים, אנו מזהים את הדרישה ל- Naו 1.7 בוויסות סומטי (סף כאב חום מזיק) אך לא באיתות כאבים קרביים. תוצאות אלו מאפשרות לנו להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס התמרה של גירויים מזיקים מהקרביים, מציעים כי יש לבצע את חקירת מסלולי הכאב באופן ספציפי למודליות ולעזור לכוון את מאמצי גילוי התרופות לעבר משככי כאבים קרביים חדשים.

תַקצִיר: תעלת נתרן משולבת מתח Naו 1.7 נדרש לכאב חריף ודלקתי בעכברים ובבני אדם אך המשמעות שלו לכאבים קרביים אינה ידועה. כאן אנו בוחנים את תפקידה של Naו 1.7 בעיבוד כאבים קרביים ופיתוח היפראלגזיה מופנית באמצעות Na מותנה ספציפית ל- nociceptorו 1.7 עכבר נוקאאוט (Naו 1.7 Nav1.8) ו- Na מולקולה קטנה סלקטיביתו 1.7 אנטגוניסט PF-5198007. Naו 1.7 עכברי Nav1.8 הראו התנהגויות נוסיספטיות תקינות בתגובה ליישום תוך -קולוני של קפסאיצין או שמן חרדל, גירויים הידועים כמעוררים פעילות נוסיצפטור מתמשכת ורגישות בעקבות נזק לרקמות, בהתאמה. תגובות נורמליות לאחר אינדוקציה של דלקת שלפוחית ​​השתן על ידי ציקלופוספמיד נצפו גם בשני Naו 1.7 פקדים של Nav1.8 וחברי המלטה. אובדן, או חסימה, של Naו 1.7 לא השפיע על תגובות אפרפרות לגירויים מכניים וכימיים מזיקים בהכנות מעי עצב בעכבר, או בעקבות אנטגוניזם של Naו 1.7 בנספח אנושי שנכרת מגורה על ידי לחצים מתרחבים מזיקים. עם זאת, ניתוח ביטוי של יחידות משנה α ערוץ נתרן עם מתח מגודר גילה Naו 1.7 תמלילי mRNA כמעט בכל נוירונים המעי הגס שכותרתם בדיעבד, מה שמרמז על יתירות בתפקוד. לעומת זאת, באמצעות מודלים התנהגותיים סומטיים השוואתיים אנו מזהים את המחיקה הגנטית של Naו 1.7 (ב- Naו נוירונים המבטאים 1.8) מסדיר את סף כאבי החום המזיקים וכי ניתן לסכם זאת על ידי ה- Na הסלקטיבי.ו 1.7 אנטגוניסט PF-5198007. הנתונים שלנו מוכיחים כי Naו 1.7 (ב- Naו 1.8 נוירונים המבטאים) תורם למסלולי כאב מוגדרים באופן תלוי מודליות, המאפיינים כאבי חום רעילים סומטיים, אך אינו נדרש לעיבוד כאבים קרביים, ותומכים בחסימה פרמקולוגית של Naו 1.7 לבדו בתוך הקרביים עשוי להיות לא מספיק למקד כאב כרוני.

מילות מפתח: NaV1.7 כאבי חום במעי הגס וקרביים nociception תחושה של כאב קרביים מתח נתרן מגודר.

© 2017 המחברים. כתב העת לפיזיולוגיה © 2017 החברה הפיזיולוגית.

דמויות

איור 1. התנהגויות ספציפיות הקשורות לכאבים קרביים ב…

איור 1. התנהגויות ספציפיות הקשורות לכאב -קרביים ב- Na ו 1.7 עכברי Nav1.8 ועכשיו המלוכלכים עוקבים אחרי ...

איור 2. התנהגויות הקשורות לכאבים קרביים עוררו ...

איור 2. התנהגויות הקשורות לכאב קרביים המעוררות על ידי דלקת שלפוחית ​​השתן המושרה על ידי ציקלופוספמיד ב- Na ו 1.7 Nav1.8…

איור 3. תגובות אפרסריות עוקצניות למזיקים ...

איור V…

איור 4. השפעת קפסאיצין וחרדל…

איור 4. השפעת קפסאיצין ושמן חרדל על תגובות אפרסריות פנימיות

איור 5. ביטוי של תעלת נתרן עם מתח ...

איור 5. ביטוי של תמלילי mRNA של ערוץ נתרן עם מתח בשערים בנוירונים חושי של המעי הגס על ידי ...

איור 6. התנהגויות כאב סומאטי וטיביאלי ...

איור 6. התנהגויות כאב סומאטי ופעילות עצבית הטיביאלית לגירוי תרמי מזיק בנא ...

איור 7. השפעת האנטגוניזם הסלקטיבי של מולקולות קטנות…

איור 7. השפעת האנטגוניזם הסלקטיבי של מולקולה קטנה של Na ו 1.7 בנספחים אנושיים שנקטעו ...


מתי להשתמש במחקר לא ניסיוני

כפי שראינו בפרק האחרון, מחקר ניסיוני מתאים כאשר יש לחוקר שאלת מחקר או השערה ספציפית לגבי קשר סיבתי בין שני משתנים - וניתן, אפשרי ואתי לתפעל את המשתנה הבלתי תלוי. לכן יש מקום למחקר שאינו ניסיוני מתאים-אפילו הכרחי-כאשר לא מתקיימים תנאים אלה. ישנן פעמים רבות שבהן עדיף מחקר לא ניסיוני, כולל כאשר:

  • שאלת המחקר או ההשערה מתייחסים למשתנה יחיד ולא לקשר סטטיסטי בין שני משתנים (למשל, עד כמה ההתרשמות הראשונה של אנשים מדויקת?).
  • שאלת המחקר מתייחסת לקשר סטטיסטי שאינו סיבתי בין משתנים (למשל, האם יש מתאם בין אינטליגנציה מילולית לאינטליגנציה מתמטית?).
  • שאלת המחקר עוסקת בקשר סיבתי, אך לא ניתן לתמרן את המשתנה הבלתי תלוי או לא ניתן להקצות משתתפים באופן אקראי לתנאים או לסדרי תנאים מסיבות מעשיות או אתיות (למשל, האם פגיעה בהיפוקמפוס של אדם פוגעת ביצירת זיכרון לטווח ארוך עקבות?).
  • שאלת המחקר רחבה ובוחנת, או עוסקת באיך זה לחוות חוויה מסוימת (למשל, איך זה להיות אם עובדת שאובחנה כסובלת מדיכאון?).

שוב, הבחירה בין הגישות הניסיוניות והלא ניסיוניות מוכתבת בדרך כלל על פי אופי שאלת המחקר. נזכיר כי שלוש מטרות המדע הן לתאר, לחזות ולהסביר. אם המטרה היא להסביר ושאלת המחקר נוגעת לקשרים סיבתיים, הרי שבדרך כלל הגישה הניסיונית מועדפת. אם המטרה היא לתאר או לחזות, גישה לא ניסיונית תספיק. אך ניתן להשתמש בשתי הגישות גם כדי להתייחס לאותה שאלת מחקר בדרכים משלימות. לדוגמה, באופן דומה, לאחר המחקר המקורי שלו, מילגרם ערך ניסויים כדי לחקור את הגורמים המשפיעים על ציות. הוא ניהל מספר משתנים עצמאיים, כגון המרחק בין הנסיין והמשתתף, המשתתף והקונפדרציה ומיקום המחקר (מילגרם, 1974) [1].


עיצוב מערך פריימר ספציפי לאיתור גרסה B.1.1.7 SARS-CoV-2 באמצעות למידה עמוקה

שושלת גרסת SARS-CoV-2 B.1.1.7, הידועה גם בשם GRade מ- Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID), Nextstrain clade 20B, או Variant Under Investigation בדצמבר 2020 (VUI-202012/01), נראה שיש יכולת העברה מוגברת בהשוואה לגרסאות אחרות. לכן, כדי להכיל ולחקור גרסה זו של וירוס SARS-CoV-2, יש צורך לפתח בדיקה מולקולרית ספציפית לזיהוי שלה באופן ייחודי. באמצעות צינור אוטומטי לחלוטין הכולל טכניקות למידה מעמיקה, עיצבנו ערכת פריימר ספציפית ל- SARS-CoV-2 גרסה B.1.1.7 בדיוק & gt99%, החל מ- 8,923 רצפים מ- GISAID. ערכת הפריימר המתקבלת נמצאת באזור המוטציה הנרדפת C16176T בגן ORF1ab, תוך שימוש ברצף הקנוני של הגרסה B.1.1.7 כהפניה. נוסף ב-סיליקו בדיקות מראות כי רצפי קבוצת הפריימר אינם מופיעים בנגיפים שונים, באמצעות 20,571 דגימות וירוסים מהמרכז הלאומי למידע על ביוטכנולוגיה (NCBI), וגם לא בנגיפי קורונה אחרים, באמצעות 487 דגימות ממרכז הנתונים הלאומי לגנומיקה (NGDC). לסיכום, ניתן לנצל את מערך הפריימר המוצג כחלק מגישה מרובעת באבחון הראשוני של חולי Covid-19, או לשמש שלב אבחון שני במקרים שכבר חיוביים ל- Covid-19, לזיהוי אנשים הנושאים את B. 1.1.7 גרסה.


בחקירת סיליקו של גרסאות SARS-CoV-2 החדשות בבריטניה (B.1.1.7) ודרום אפריקה (501Y.V2) עם דגש על ממשק ACE2-Spike RBD

SARS-CoV-2 מנצל אנזים 2 הממיר אנגיוטנסין (ACE2) כקולטן לפלישה לתאים. דווח כי הזנים בבריטניה ובדרום אפריקה עשויים להיות בעלי יכולות העברה גבוהות יותר, בסופו של דבר בשל החלפות חומצות אמינו בחלבון SARS-CoV-2 Spike. נראה שהפתוגניות משתנה אך היא עדיין בבדיקה. כאן השתמשנו במבנה הניסוי של תחום Spike RBD המתגבש יחד עם חלק מקולטן ACE2 וכמה בשיטות סיליקו כדי לנתח את ההשפעות האפשריות של שלוש תחליפי חומצות אמינו (Spike K417N, E484K, N501Y) ביחס לקשירת ACE2. גילינו שההחלפה N501Y באזור זה של הממשק (קיימת בשני זנים בבריטניה ובדרום אפריקה) אמורה להיות חיובית לאינטראקציה עם ACE2 בעוד שההחלפות K417N ו- E484K (דרום אפריקה) ייראו שליליות. לא ברור אם ההחלפה N501Y בזן הדרום אפריקאי עשויה לאזן את תחליפי ה- K417N וה- E484K ספייק פחות חיוביים (לגבי מחייב). הממצא שלנו מצביע על כך שאם אכן לזן הדרום אפריקאי יש רמת שידור גבוהה, זה יכול לנבוע מההחלפה N501Y ו/או מהתחלפות באזורים מחוץ לממשק ישיר של Spike-ACE2.

העברת זני SARS-CoV-2 בבריטניה ואולי בדרום אפריקה נראית מוגברת משמעותית בהשוואה לגרסאות אחרות

זה יכול לנבוע, בין היתר, מזיקה מוגברת בין חלבוני הספייק הגרסאיים לבין ACE2

חקרנו בסיליקו את המבנה התלת-ממדי של מתחם Spike-ACE2 תוך התמקדות ב- Spike K417N, E484K ו- N501Y

תחליף N501Y צפוי להגדיל את הזיקה ל- ACE2 (זן בריטניה) עם העברה משופרת לאחר מכן ואולי פתוגניות.

החלפות נוספות בעמדות 417 ו -484 (זן דרום אפריקאי) עשויות להוות תחושת אינטראקציה עם ACE2 ומעלות שאלות לגבי העברה ופתוגניות.


השערות מכאניות להתפשטות המהירה

כדי להבין מנגנונים ביולוגיים אפשריים להתפשטות מהירה יותר של VOC 202012/01 ביחס לגרסאות קיימות, הרחבנו מודל מתמטי מובנה גיל ומבנה אזורית של שידור SARS-CoV-2 (10, 15) לשקול שתי וריאציות מחזוריות (איור S8 וטבלאות S2 ו- S3). המודל משתמש בנתוני ניידות של Google (11), מאומת על ידי סקרי קשר חברתי (10), כדי ללכוד שינויים בדפוסי הקשר לאורך זמן עבור כל אזור באנגליה. יצרנו חמש גרסאות של המודל, כל אחת כולל פרמטר חלופי אחד הלוכד מנגנון פוטנציאלי.

ההשערות שבדקנו הן כדלקמן. ראשית, תצפיות על ערכי סף מחזור נמוך (Ct) (1618) - כלומר, עומס ויראלי גבוה יותר - תומך ברעיון ש- VOC עשוי להיות מועבר יותר לכל מגע עם אדם מדבק מאשר גרסאות קיימות (השערה 1). שנית, נתוני בדיקה לאורך (17) עולה כי VOC עשוי להיות קשור לתקופה ארוכה יותר של נשירה ויראלית ומכאן לתקופה זיהומית ארוכה יותר (השערה 2). שלישית, מחיקת ∆H69/70V70 בספייק תרמה לבריחה חיסונית של חולה עם פגיעה בחיסון (7), המצביע על כך שחסינות בפני גרסאות קיימות עשויה לספק הגנה מופחתת מפני זיהום ב- VOC (השערה 3). רביעית, ההתפשטות הראשונית של VOC במהלך הנעילה בנובמבר 2020 באנגליה, שבמהלכה בתי הספר היו פתוחים, מצביעה על כך שילדים עלולים להיות רגישים יותר לזיהום ב- VOC מאשר עם וריאנטים קיימים (השערה 4). ילדים בדרך כלל פחות רגישים לזיהום SARS-CoV-2 מאשר מבוגרים (19, 20), אולי בגלל הגנה צולבת חיסונית עקב נגיפי קורונה אנושיים אחרים (21), שיכול להגן פחות מפני VOC. לבסוף, ל- VOC יכול להיות זמן דור קצר יותר מאשר גרסאות קיימות (השערה 5). זמן דור קצר יותר יכול להסביר את קצב הגידול המוגדל מבלי לדרוש מספר רבייה גבוה יותר, מה שיהפוך את השליטה ב- VOC 202012/01 באמצעות אמצעי ריחוק חברתי לקל יותר להשגה.

אנו מתאימים כל דגם לסדרות זמן של מקרי מוות מ- COVID-19, אשפוזים בבית החולים, תפוסה במיטה בבית החולים ובטיפול נמרץ, שכיחות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), שכיחות, ושיעור בדיקות SARS-CoV-2 בקהילה עם כשל במטרה בגן S בכל שלושה אזורי NHS באנגליה המושפעים ביותר, בתקופה שבין 1 במרץ ל -24 בדצמבר 2020 (איור 3 ואיורים S9 עד S14). הערכנו מודלים באמצעות קריטריוני מידע סטייה (DIC) והשווינו את תחזיות המודל לנתונים שנצפו במשך 14 הימים שלאחר תקופת ההתאמה (כלומר, 25 בדצמבר 2020–7 בינואר 2021). מתוך חמש ההשערות שנבדקו, השערה 1 (העברה מוגברת) הייתה בעלת ה- DIC המשולב הנמוך ביותר (כלומר הטוב ביותר) וחריגה מנבאת. השערה 2 (תקופה זיהומית ארוכה יותר) והשערה 4 (רגישות מוגברת בילדים) התאימו גם הם לנתונים, אם כי השערה 4 אינה נתמכת היטב על ידי נתוני קצב ההתקף המשני של הבית (איור S15) או על ידי דפוסים ספציפיים לגיל של יעד הגן S כישלון בקהילה (איור S16), אף אחד מהם לא מזהה עלייה ניכרת ברגישות בקרב ילדים. השערה 3 (בריחה חיסונית) והשערה 5 (זמן דור קצר יותר) מתאימות לא טוב (איור 3 א וטבלה S4). בפרט, השערה 5 ניבאה כי התדירות היחסית של VOC 202012/01 הייתה צריכה לרדת במהלך מגבלות מחמירות בסוף דצמבר 2020, כי כאשר לשתי גרסאות יש אותו מספר רבייה יעיל רt & lt 1 אך זמני דור שונים, זיהומים יורדים מהר יותר עבור הגרסה עם זמן הדור הקצר יותר.

כל שורה מציגה מנגנון משוער אחר. (א) תדירות יחסית של VOC 202012/01 (הקו השחור והסרט בהתאמה מציינים תדירות כשל מטרה בגן S עם 95% מרווח בינומי אמיתי קו וסרט בהתאמה מציינים ממוצע ו 95% מרווח אמין מההתאמה לדגם). (ב) אומדנים אחוריים (ממוצע ו -95% מרווחים אמינים) לסיכויים יחסית לאשפוז (מחלה קשה), סיכויים יחס לאשפוז נמרץ (מחלה קשה), סיכויי מוות יחסית (מחלה קטלנית), קצב צמיחה כגורם כפל לשבוע [כלומר , exp (7 · ∆r)], והפרמטר המגדיר את המנגנון המשוער כל הפרמטרים הם יחסית לאלו המוערכים עבור גרסאות קיימות. (ג ל ה) מודל המחשה מתאים לאזור דרום מזרח NHS באנגליה: (C) הותקן דגם העברה מוגבר דו-זני עם VOC 202012/01 כלול (D) מצויד מודל העברה מוגברת דו-זן עם VOC 202012/01 מוסר (E) מצויד יחיד- מודל זן ללא הופעת VOC 202012/01. קווים שחורים מציינים פסי שגיאה בנתונים מציינים את טווח התאריכים ומרווחים אמינים של 95% לשכיחות PCR שנצפתה וקווים צבעוניים וסרטים מציינים חציון ו 95% מרווחים מהימנים מהתאמת הדגם.

התקנו מודל משולב המשלב את חמש ההשערות לעיל, אך הוא לא הצליח לזהות מנגנון עקבי אחד באזורי NHS באנגליה ומכאן שמגוון רחב של ערכי פרמטרים תואמים את קצב הגידול הנצפה של VOC 202012/01 (איור S14 ). On the basis of our analysis, we identify increased transmissibility as the most parsimonious model, but we emphasize that the five mechanisms explored here are not mutually exclusive and may be operating in concert.

The increased transmissibility model does not identify a clear increase or decrease in the severity of disease associated with VOC 202012/01, finding similar odds of hospitalization given infection [odds ratio, 0.92 95% credible interval (CrI), 0.77 to 1.10], critical illness [odds ratio, 0.90 (CrI, 0.58 to 1.40)], and death [odds ratio, 0.90 (0.68 to 1.20)] when the model was fitted to the three most heavily affected NHS England regions (Fig. 3B). These estimates should be treated with caution, as we would not expect to identify a clear signal of severity when fitting to data up to 24 December 2020, given delays between infection and hospitalization or death. However, the fitted model finds strong evidence of higher relative transmissibility, estimated at 65% (CrI, 39 to 93%) higher than preexisting variants for the three most heavily affected NHS England regions, or 82% (CrI, 43 to 130%) when estimated across all seven NHS England regions (Table 1, model 5a). These estimates of increased transmissibility are consistent with our statistical estimates and with a previous estimate of a 70% increased reproduction number for VOC 202012/01 (16). This model reproduces observed epidemiological dynamics for VOC 202012/01 (Fig. 3C and fig. S17). Without the introduction of a new variant with a higher growth rate, the model is unable to reproduce observed dynamics (Fig. 3, D and E, and figs. S17 to S19) these findings lend further support to the idea that changing contact patterns do not explain the spread of VOC 202012/01.


1.7: Nonexperimental Scientific Investigations - Biology

In the phylogenetic tree shown, which organism is most distantly related to 2? In the diagram shown which is the most recent common ancestor of 1 and 3?
  1. אי - קולי is a eukaryote and share similarities with most of the living organisms.
  2. אי - קולי is a prokaryote. The various metabolic processes and core functions in אי - קולי share homology with higher organisms.
  3. אי - קולי contains a nucleus and membrane bound cell organelles that are shared by all the living organisms.
  4. אי - קולי is a prokaryote and reproduces through binary fission which is common to most of the living organisms.
  1. Archeopteryx is the connecting link between birds and reptiles which shows that birds and reptiles are related.
  2. Birds have scales, having the same origin as that of reptiles.
  3. Birds and reptiles have the same circulatory and excretory systems and both are egg laying animals.
  4. Birds and reptiles have similar anatomical and morphological features.
  • אתה כאן:  
  • בית
  • Andover Biology Department Textbooks
  • Openstax Biology for AP Courses (textbook for Bio58x sequence)
  • Bio581
  • Chapter 1 The Study of Life
  • 1.7 Test Prep for AP Courses

This text is based on Openstax Biology for AP Courses, Senior Contributing Authors Julianne Zedalis, The Bishop's School in La Jolla, CA, John Eggebrecht, Cornell University Contributing Authors Yael Avissar, Rhode Island College, Jung Choi, Georgia Institute of Technology, Jean DeSaix, University of North Carolina at Chapel Hill, Vladimir Jurukovski, Suffolk County Community College, Connie Rye, East Mississippi Community College, Robert Wise, University of Wisconsin, Oshkosh

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License, with no additional restrictions


Study evaluates potential causes of increased transmission in SARS-CoV-2 variants

Washington, D.C. - June 20, 2021 - Although two SARS-CoV-2 variants are associated with higher transmission, patients with these variants show no evidence of higher viral loads in their upper respiratory tracts compared to the control group, a Johns Hopkins School of Medicine study found.

The emergence and higher transmission of the evolving variants of SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19, has been concerning. The researchers investigated B.1.1.7, the variant first identified in the UK, and B.1.351, the variant first identified in South Africa, to evaluate if patients showed higher viral loads, and consequently increased shedding and transmissibility.

Variants were identified using whole genome sequencing. Researchers used a large cohort of samples to show that the UK variant constituted 75% of the circulating viruses by April 2021. The researchers compared 134 variant samples to 126 control samples and with access to the patients' clinical information, were able to correlate the genomics data with the clinical disease and outcomes. All samples underwent additional testing to determine their viral load. The information was associated with the stage of the disease by looking at the days after the start of symptoms which added clarity in comparing viral shedding between groups.

"The reason why these variants show higher transmissibility is not yet clear," said Adannaya Amadi, lead author on the study. "However, our findings did show that the patients infected with these variants are less likely to be asymptomatic compared to the control group. Although those infected with the variants were not at higher risk for death or intensive care admission, they were more likely to be hospitalized."

This study was performed at Dr. Heba Mostafa's research laboratory at Johns Hopkins School of Medicine, which has been performing large scale whole genome sequencing of SARS-CoV-2 for the State of Maryland and contributing data to the national publicly available surveillance figures.

Alex Luo, C. Paul Morris, Matthew Schwartz, Eili Y. Klein and Heba H. Mostafa also contributed to this work. The study was funded by NIH, the Johns Hopkins Department of Pathology, The Johns Hopkins University and the Maryland Department of Health.

This abstract will be presented at the World Microbe Forum online from June 20-24 live from Baltimore, Maryland. World Microbe Forum is a collaboration between the American Society for Microbiology (ASM), the Federation of European Microbiological Societies (FEMS), and several other societies, which is breaking barriers to share science and address the most pressing challenges facing humankind today.

כתב ויתור: AAAS ו- EurekAlert! אינם אחראים לדיוק מהדורות החדשות שפורסמו ל- EurekAlert! על ידי מוסדות תורמים או לשימוש במידע כלשהו באמצעות מערכת EurekAlert.


Uveal melanoma: From diagnosis to treatment and the science in between

Melanomas of the choroid, ciliary body, and iris of the eye are collectively known as uveal melanomas. These cancers represent 5% of all melanoma diagnoses in the United States, and their age-adjusted risk is 5 per 1 million population. These less frequent melanomas are dissimilar to their more common cutaneous melanoma relative, with differing risk factors, primary treatment, anatomic spread, molecular changes, and responses to systemic therapy. Once uveal melanoma becomes metastatic, therapy options are limited and are often extrapolated from cutaneous melanoma therapies despite the routine exclusion of patients with uveal melanoma from clinical trials. Clinical trials directed at uveal melanoma have been completed or are in progress, and data from these well designed investigations will help guide future directions in this orphan disease. Cancer 2016122:2299-2312. © 2016 American Cancer Society.

מילות מפתח: breast cancer 1-associated protein 1 (BAP1) choroidal melanoma diagnosis guanine nucleotide binding protein α11 (GNA11) guanine nucleotide-binding protein Q polypeptide (GNAQ) ocular melanoma review science treatment uveal melanoma.

© 2016 American Cancer Society.

הצהרת ניגוד אינטרסים

Conflict of Interest: BE and SW are scientific committee members for the Uveal Melanoma TCGA. SP received research funding to conduct clinical trials and perform translational research in uveal melanoma. All other authors endorse no conflict of interest with the subject of this manuscript.


חומרים ושיטות

אֶתִיקָה

ארצות הברית.

The Institutional Review Board (IRB) from the Yale University Human Research Protection Program determined that the RT-qPCR testing and sequencing of de-identified remnant COVID-19 clinical samples conducted in this study is not research involving human patients (IRB Protocol ID: 2000028599).

Brazil.

Sample collection and genetic characterization were approved under the Brazilian National IRB (CONEP) CAAE 30101720.1.0000.0068.

דרום אפריקה.

We used de-identified remnant nasopharyngeal and oropharyngeal swab samples from patients testing positive for SARS-CoV-2 by RT-qPCR from public health and private medical diagnostics laboratories in South Africa. The project was approved by University of KwaZulu-Natal Biomedical Research Ethics Committee (protocol reference no. BREC/00001195/2020 project title: COVID-19 transmission and natural history in KwaZulu-Natal, South Africa: epidemiological investigation to guide prevention and clinical care). Individual participant consent was not required for the genomic surveillance. This requirement was waived by the research ethics committees.

The sample IDs displayed in S2 נתונים are not known outside the research groups and cannot be used to reidentify any subject.

Analysis of public SARS-CoV-2 genomes

All available SARS-CoV-2 data (402,899 genomes) were downloaded on January 22, 2021 from GISAID and evaluated for the presence of ORF1a Δ3675–3677 and spike Δ69–70. Phylogenetic analysis of a subset of 4,046 SARS-CoV-2 genomes was performed using Nextstrain [14], downsampled as shown using the “global build” on January 22, 2021 (https://nextstrain.org/ncov/global). A list of SARS-CoV-2 genomes used in the analysis is available in נתוני S1.

Multiplex RT-qPCR with probes

A detailed protocol of our multiplexed RT-qPCR to screen for SARS-COV-2 B.1.1.7, B.1.351, and P.1 VOC can be found on protocols.io [17]. In brief, our multiplex RT-qPCR assay consists of the CDC N1 [15] and the newly designed ORF1a Δ3675–3677 and spike Δ69–70 primer–probe sets (S2 Table). We used the NEB Luna universal probe 1-Step RT-qPCR kit with 200 nM of N1 primers, 100 nM of N1 probe, 400 nM of the ORF1a and spike primers, 200 nM of ORF1a and spike probes, and 5 μL of nucleic acid in a total reaction volume of 20 μL. Thermocycler conditions were reverse transcription for 10 minutes at 55°C, initial denaturation for 1 minute at 95°C, followed by 40 cycles of 10 seconds at 95°C and 30 seconds at 55°C. During initial validation, we ran the PCR for 45 cycles. Differentiation between VOC is based on target failure of the ORF1a and/or spike primer–probe sets (שולחן S3).

Limit of detection

We used Twist synthetic SARS-CoV-2 RNA controls 2 (GenBank ID: MN908947.3 GISAID ID: Wuhan-Hu-1) and control 14 (GenBank ID: EPI_ISL_710528 GISAID ID: England/205041766/2020) to determine the limit of detection of the screening RT-qPCR assay. We tested a 2-fold dilution series from 100 copies/μL to 1 copy/μL for both RNA controls in triplicate and confirmed that the lowest concentration that was detected in all 3 replicates by 20 additional replicates.

Validation and sequence confirmation

ארצות הברית.

We validated our approach using known SARS-CoV-2 positive clinical samples. Briefly, we extracted nucleic acid from 300 μL viral transport medium from nasopharyngeal swabs and eluted in 75 μL using the MagMAX viral/pathogen nucleic acid isolation kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States). Extracted nucleic acid was tested by our multiplexed RT-qPCR assay and then sequenced using the Illumina COVIDSeq Test RUO version for the NovaSeq (paired-end 150), or using a slightly modified ARTIC Network nCoV-2019 sequencing protocol for the Oxford Nanopore MinION [20,21]. These modifications include extending incubation periods of ligation reactions and including a bead-based clean-up step following dA-tailing. MinION sequencing runs were monitored using RAMPART [22]. Consensus sequences were generated using the ARTIC Network bioinformatics pipeline and lineages were assigned using Pangolin v.2.0 [23,24]. GISAID accession numbers for all SARS-CoV-2 genomes used to validate our approach are listed in S2 Data.

Brazil.

To validate the detection of the P.1 lineage, we selected 23 samples (16 P.1 and 7 others) that had been sequenced using the ARTIC protocol on the MinION sequencing platform, as previously described [12,25]. In brief, viral RNA was isolated from RT-PCR positive samples using QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany), following the manufacturer’s instructions. cDNA was synthesized with random hexamers and the Protoscript II First Strand cDNA synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, United States). Whole genome multiplex-PCR amplification was then conducted using the ARTIC network SARS-CoV-2 V3 primer scheme with the Q5 High-Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs). Multiplex-PCR products were purified by using AmpureXP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, United States), and quantification was carried out using the Qubit dsDNA High Sensitivity assay on the Qubit 3.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, United States). Samples were then normalized in an equimolar proportion of 10 ng per sample. After end repair and dA tailing, DNA fragments were barcoded using the EXP-NBD104 (1–12) and EXP-NBD114 (13–24) Native Barcoding Kits (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, United Kingdom). Barcoded samples were pooled together and sequencing adapter ligation was performed using the SQK-LSK 109 Kit (Oxford Nanopore Technologies). Sequencing libraries were loaded onto an R9.4.1 flow-cell (Oxford NanoporeTechnologies) and sequenced using MinKNOW version 20.10.3 (Oxford Nanopore Technologies). We tested RNA from sequenced samples with the multiplex RT-qPCR as described above using the Applied Biosystems 7500 real-time PCR machine (Thermo Fisher Scientific) and a lowered threshold of Ct 30.

דרום אפריקה.

We extracted nucleic acid using the Chemagic 360 (PerkinElmer, Waltham, MA, United States). Briefly, 200 μl of viral transport medium from each swab sample was extracted and eluted in 100 μl using the Viral NA/gDNA kit. Complementary DNA (cDNA) synthesis, PCR, whole genome sequencing, and genome assembly was done as previously described in detail using the ARCTIC protocol [11,20]. Out of the sequenced samples, we selected 24 B.1.351 samples and 24 samples belonging to other lineages to validate the RT-qPCR assay. We adapted the protocol by using the TaqPath 1-Step multiplex master mix (Thermo Fisher Scientific) with 5 μl of extracted nucleic acid in a total reaction volume of 20 μl. Samples were amplified using the QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System using the following PCR conditions: Uracil-N-glycosylase (UNG) incubation for 2 minutes at 25°C, reverse transcription for 15 minutes at 50°C, polymerase activation for 2 minutes at 95°C, followed by 40 cycles of amplification at 95°C for 3 seconds and 55°C for 30 seconds.


צפו בסרטון: וובינר: בחינת הקמת תשתית למופ בביולוגיה סינטטית (יָנוּאָר 2022).