מֵידָע

כיצד לדגור תרבות מיובשת בהקפאה?


יש לי תרבות מיובשת בהקפאה staphylococcus aureus; איך אני מדגירה את זה?

האם אני יכול לערבב אותו למרק של לוריה ופשוט לשמור אותו בחממה?


מיקרואורגניזמים רבים אינם סובלים ייבוש הקפאה (כדאי להקפיא אותם באמצעות חומרי הגנה קריו). ככל הנראה סטפילוקוקוס יכול לסבול את זה. אתה לא שם ישירות את התאים המיובשים במדיום. ראשית עליך לייבש מחדש את התאים באמצעות המדיום ולאחר מכן להעבירם לכלי התרבות. עיין בהוראות הבאות של ATCC:

השיטה המועדפת לשימור לטווח ארוך של חיידקים ואצות היא ייבוש הקפאה; עם זאת, חלק מהחיידקים אינם שורדים היטב את ייבוש ההקפאה והם קפואים במקום זאת. לתרבויות מיובשות בהקפאה, באמצעות צינור אחד של התקשורת המומלצת (5 עד 6 מ"ל), משוך כ- 0.5 עד 1.0 מ"ל בעזרת פיפטר פסטר או 1.0 מ"ל. השתמש בזה כדי לייבש מחדש את כל הגלולה, ולהעביר את כל ההשעיה בחזרה לצינור המרק ולערבב היטב. הטיפות האחרונות של ההשעיה עשויות להיות מועברות גם לאלכסון. לחלופין, יש ליזום תרבויות אצות על צלחות אגר. אנא שימו לב כי תרבויות חיידקים אנאירוביים חייבים להיות מיובשים מחדש בסביבה אנאירובית; הכדאיות של התאים יורדת במהירות אם הבקבוקון מתייבש מחדש בסביבה חמצנית.

דגירה של תרבויות בתנאים המתאימים. בהתחשב בטיפול והתנאים המתאימים, רוב התרבויות המיובשות בהקפאה יצמחו תוך מספר ימים. עם זאת, חלקם עשויים להוות תקופת השהיה ממושכת ויש לתת להם פי שניים מזמן הדגירה הרגיל לפני השלכתם כבלתי קיימא.

אם היית מקבל את התאים ממאגר כלשהו או מספק, היית מקבל גם מדריך הוראות כיצד להחיות את התאים ובאיזה מדיה להשתמש. עדיף לעקוב אחר ההוראות הספציפיות המופיעות במדריך.


פרוטוקול ייבוש הקפאת חיידקים

ל- OPS Diagnostics מספר מוצרים אשר מועילים לייבוש חיידקים בהקפאה, כמו גם שירות ליופליזציה. המוצרים הרלוונטיים לייבוש הקפאה כוללים מאגר ייבוש הקפאה מיקרוביאלי, חומרים עזר (כגון מניטול, סוכרוז וטרהלוז), בקבוקונים בסרום ואביזרים קריוגניים קשורים.

חיידקי ייבוש הקפאה הם שיטה שימושית לשימור לטווח ארוך. חיידקים לייבוש הקפאה הוא תהליך רב שלבי הכולל גידול החיידקים, השעייתם במדיום/מאגר ליופליזציה, הכפפתם לתהליך ייבוש ההקפאה, ולאחר מכן אחסוןם כראוי. לדיון מעמיק יותר על תהליך ייבוש ההקפאה, ראה Lyophilization חיידקי: סקירה כללית. הפרוטוקול הכללי שלהלן נועד לספק מדריך לאנשים חדשים שחיידקים חיידקים. לכל מעבדה יש ​​כלים ומכשירים שונים, ולכן ניתנות הצעות כיצד להתאים חומרים זמינים לפרוטוקול הסטנדרטי.

אף שיטה אחת לא תעבוד על כל המיקרואורגניזמים. שיטה שפותחה עבור מייבש הקפאה אחד לא בהכרח תתורגם לדגם אחר או לדגם אחר.

לא כל החיידקים ניתנים להקפאה בהצלחה. זנים מסוימים, כגון מוטציות עם ממברנות חסרות, עלולים שלא לשרוד את התהליך או עלולים למות במהירות לאחר ייבוש ההקפאה.

אמצעי התקנה ליופרוטטיביים, כגון תמיסת חלב דל שומן, תמיסת סוכרוז או מאגרי ייבוש הקפאה אחרים יכולים להשפיע באופן דרמטי על שיעורי ההישרדות.

בקבוקונים המשמשים לייבוש הקפאה צריכים להיות עשויים תמיד מזכוכית. מים אטמוספריים יכולים להתפזר לצינורות פלסטיק ולפגוע בדגימות מיובשות. יתר על כן, הדגימות הבטוחות ביותר כאשר להבה אטומה תחת ואקום באמפולות זכוכית או צינורות.

יש לבדוק פרוטוקולי ייבוש בהקפאה לפני התחייבות לפרויקטים בהיקפים גדולים. ההערכה יכולה להימשך 1-2 חודשים ולהניב תוצאות המצביעות על תאים יהיו יציבים למשך זמן ארוך.

הנוזל המשמש לייבוש מחדש של חיידקים מיובשים בהקפאה יכול להשפיע על הכדאיות. מרק תרבות, למשל, TSA או LB, משמש לעתים קרובות, וכך גם 0.9% NaCl.

כמו כל תהליך, ההכנה יכולה להימשך זמן רב יותר מהחלק המעשי של ייבוש ההקפאה עצמו. חשוב שכל הפתרונות, בקבוקונים, פקקים, צמר זכוכית וכו 'יעוקרו לפני שמתחילים.

תיעוד - חיוני לנהל רישומים מדויקים של חיידקים מגובשים וכן להשתמש בטכניקות מהימנות לסימון דגימות בודדות. אנו ממליצים להשתמש ביומן קשיח, יומן הקפאה לייבוש בו ניתן להקליט כל אצווה של דגימות מעובדות. תיוג הצינורות/בקבוקונים הוא גם קריטי ויש לעשות זאת באמצעות תווית עמידה. מדפסות לכתיבת צינורות ותיוג יד הן אופציות כל עוד הדיו אינו ניתן למחיקה. ניתן לבצע טכניקת תיוג של קוצץ על ידי הנחת תוויות נייר קטנות וסטריליות בתוך צינור הדגימה (בדרך כלל מונחות על הקירות כך שהיא לא נוגעת בתרבית) אשר נאטמת לאחר מכן בצינור יחד עם הדגימה.

בינוני לופיליזציה - חיידקים זקוקים לחומר מגן, המסייע להם לשרוד את תהליך ייבוש ההקפאה. מדיום זה יכול להיות פשוט מאוד, כגון 10% חלב דל שומן, או מסובך כגון אלה המשתמשים בסרה של בעלי חיים. לתקשורת טובה שני מרכיבים עיקריים: חומר ההגנה המייצב את התאים בעת הסרת מים, וסוכן מטריקס המאפשר לדגימה כולה לשמור על צורתה במהלך העיבוד ולאחריו. סוכרים כמו סוכרוז וטרהלוז הם חומרים מעולים ליופרוטיים. תוספים ליצירת מטריצות, המכונים לעתים קרובות חומרים עזר, כוללים מניטול, BSA, סרום וחלב דל שומן. להלן מספר אמצעי תקשורת נפוצים המשמשים לליופיליזציה חיידקית:

10% חלב רזה - להכנה יש לערבב 10 גרם חלב רזה מיובש עם 100 מ"ל מים מיונים ולחטא בעזרת חיטוי. מדיום זה אינו יעיל מדי אך הוא זול וקל להכנה. לחיידקים הנוגרים בחלב דל יש כדאיות של 10% או פחות בהשוואה לחלק מהניסוחים הטובים יותר המפורטים להלן.

10% סוכרוז - ממיסים 10 גרם סוכרוז ב -100 מ"ל מים יונים ומעקרים באמצעות חיטוי. סוכרוז הוא חומר ליופרוטרי המספק כדאיות טובה, במיוחד בהשוואה לחלב דל שומן. ב -10% סוכרוז משמש גם כמטריצה ​​משלו. עם זאת, חיידקים השמורים בסוכרוז חייבים להישמר קרים יותר מאשר באמצעי תקשורת אחרים במהלך הליופליזציה כדי למנוע התכה והתמוטטות של הדגימה.

מגיב 18 - ניסוח ATCC זה מעורב יותר להכנה, אך התוצאות שוות את זה. הוסף 0.75 גרם מרק סויה Trypticase, 10 גרם סוכרוז ו -5 גרם BSA חלק V למים 100 מ"ל מיונים. BSA תגרום לנתק ויתקבל אם יתבצע חיטוי, ובכך לעקר באמצעות סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרון.

מאגר ייבוש הקפאה מיקרוביאליים (OPS Diagnostics, לבנון, ניו ג'רזי) - ניסוח מסחרי זה דומה מאוד למגיב 18, אך הוא חסר חלבון מן החי (כלומר, אין BSA). עבור פרויקטים בקנה מידה גדול, זה משתלם יותר משימוש ב- BSA אשר נוטה להיות יקר מאוד.

בקבוקונים/צינורות ליופיליזציה - בקבוקונים וצינורות המשמשים לליופילציה של חיידקים (או כל דבר לצורך העניין) עשויים זכוכית. פלסטיק לא עובד, במיוחד צינורות מיקרופוגות, לאחסון לטווח ארוך (מים יכולים לעבור בפלסטיק!). הבחירה בבקבוקון או בצינור חשובה מאוד להישרדות לטווח ארוך של חיידקים מיובשים בהקפאה. ההבדל בין בקבוקונים לצינורות (אמפולות הנחשבות לצינור) הוא שבקבוקונים אטומים עם פקק ואילו צינורות/אמפולות אטומים בלהבה. להלן פרטים נוספים על בקבוקונים וצינורות.

בקבוקונים מיועדים לייבוש הקפאה במכשיר ליופילייזר מדף המצויד בצלחת עצירה. הבקבוקונים ממלאים ולאחר מכן מצוידים בפקק מפוצל, כלומר פקק בעל חריץ המאפשר זרימת גז בישיבה רופפת בפתח הבקבוקון. לאחר ייבוש ההקפאה, צלחת העצירה יורדת ודוחפת את הפקקים לתוך הבקבוקון תחת ואקום. כאשר שחרור הוואקום, הלחץ האטמוספרי מאבטח את הפקק ואת הוואקום בתוך הבקבוקון. לאחר ההסרה מהליופיליזר, הפקקים מאובטחים עוד יותר בעזרת רצועת אלומיניום שנקמטה במקומה. בקבוקונים מאוד נוחים וקלים לשימוש, אך הם יכולים לדלוף במהלך אחסון לטווח ארוך. לטווח הקצר הם טובים מאוד.

צינורות, כולל אמפולות, הם המיכל הטוב ביותר לאחסון ארוך טווח של חיידקים מיובשים בהקפאה. אלה מחוברים לרוב למפלט המחזיק מספר צינורות. צינורות ואמפולות מוקפאים באמצעות מקפיא או אמבט קרח יבש ולאחר מכן מתחברים במהירות לרצועה לפני שהם נמסים. לאחר שהדגימות מתייבשות, צוואר הצינור או האמפולה אטום באמצעות לפיד פרופאן או אצטילן. צינורות ואמפולות אטומות תחת ואקום אטומות ללחות (בהנחה שאין דליפות חור). החיסרון הוא שהם דורשים הרבה יותר עבודה בהשוואה לבקבוקונים.

ישנן תצורות רבות ושונות של צינורות, המעשיים ביותר שיתוארו כאן.

    ניתן להשתמש כמעט בכל מבחנה או צינורות זכוכית בורוסיליקט לייבוש הקפאה. זכוכית בורוסיליקט קשה יותר לאטום מאשר צינורות סודה-סיד, אך היא עמידה יותר. בשימוש בצינורות, אמצעי התרבות מתווסף לצינור סטרילי אשר מחובר אז באופן רופף עם צמר זכוכית סטרילי. הדגימה מוקפאת, מחוברת לוואקום ומעובדת. לאחר ייבוש, לפיד משמש לאטום את הצינור בין המדגם לבין סעפת הוואקום.

אמפולות הן המיכל הקל ביותר לאטום בלהבה בשל העיצוב שלהן. כאמור, ההשעיה של התא מתווספת לאמפולה סטרילית, בדרך כלל עם פיפטה של ​​פסטר או קצה מיקרופיפט צר מאוד. לאחר מכן, האמפולה מחוברת באופן רופף עם צמר זכוכית סטרילי. לאחר העיבוד, האמפולה אטומה באמצעות להבה. מכיוון שלאמפולה יש צוואר דק מאוד, הרבה יותר קל לאטום. אמפולות יכולות להיות גם רכישות שהוענקו מראש, מה שהופך את הפיצוח לפתיחה מאוד קל בהשוואה לצינורות.

גידול והכנת חיידקים

באמצעות טכניקת גידול אספטית טובה, לגדל תאים בתרבית נוזלית או על צלחות אגר עד שתרבויות מוצקות צפופות או תרבויות נוזליות נמצאות בשלב נייח מוקדם. בפועל, זה יהיה שווה ערך לרעידת תרבות חיידקים למשך הלילה או לתת לתאים לגדול על צלחת למשך 1-2 ימים. לתרבויות אגר, תאי גידול על שיפוע (צינורות זכוכית) עשויים להיות מעשיים יותר מכיוון שהוא משמיט את שלב הצנטריפוגה להלן. עם זאת, תרבויות נוזליות בדרך כלל מניבות מספר גדול יותר של תאים קיימא.

לתרבויות נוזליות, התאים מתרכזים, מרק התרבות מוסר, והכדור מושעה בנפח שווה של מדיום ליופיליזציה. אנו ממליצים על מגיב 18 או על מאגר ייבוש ההקפאה של חיידקים, אם כי חלב דל וסוכרוז יעבדו. לתרבויות אגר, הציפו את הצלחת/צינור עם 5-10 מיליליטר של מדיום lyophilization. בעזרת פיפטה סטרילית, לשטוף את המדיום על המושבות כדי לעקור את התאים. מעבירים את השעיית התא לצינור סטרילי. אנו ממליצים לבצע ספירת תאים שניתן להשוות לתאים לאחר ייבוש הקפאה. פרוטוקול דילול פשוט להכחדה זמין כאן.

Aliquot ההשעיה התא לתוך בקבוקונים או צינורות סטריליים. יש צורך רק 250-500 μl לכל בקבוקון מכיוון שהוא מייצג כ -10 8 חיידקים. הניחו פקקים מפוצלים על הבקבוקונים או צינורות תקע רופפים עם צמר זכוכית. בקבוקונים עם פקקים מפוצלים פתוחים מבחינה טכנית לאוויר, ובכך נמצאים בסכנת זיהום. בפועל לא מצאנו שזו בעיה. אם בקבוקון מכיל למעלה ממיליארד חיידקים, אחד או שניים חיידקים מזהמים הופכים לבלתי משמעותיים כאשר התרבות מתייבשת ומפוספסת. אם יש חשש לזיהום, או לבלום, ניתן להניח צמר זכוכית או כותנה מתחת לפקק כדי למנוע זיהום.

תהליך ייבוש הקפאה - ליופיליזר מדף

הפעל את הליופיליזר והפעל את המעבה. אם יש מעבה חיצוני באמצעות תערובת קרח/אתנול יבש אז מכינים גם זאת. ניתן להגדיר את המדף ל- 4 & degC.

מרכז את הבקבוקונים על המדף. מיקום זה חשוב כך שצלחת העצירה תוכל ללחוץ באופן שווה על הפקקים לאחר ייבוש ההקפאה.

באמצעות פקדים ידניים או מתוכנתים, הקפיאו את הדגימות עד -40 & degC. שלב זה אמור להימשך כ 30-60 דקות והוא תלוי מאוד במכשיר. אם ניתן לשלוט בקצב ההקפאה, ירידה של 1 & degC לדקה היא קצב מעשי. לאחר שהדגימות מגיעות לטמפרטורה, הן צריכות להיות קפואות לעין (נוזל שקוף הופך לאטום וחלב רזה נראה מוצק).

אפשר למדגם לשבת ב -40 & degC למשך שעה אחת כדי להבטיח הקפאה מלאה. בקבוקונים במרכז אשכול עשויים להקפיא לאט יותר מאשר מבחוץ.

הפעל את משאבת הוואקום. בתוך 10-20 דקות, הוואקום צריך להיות מתחת ל -200 מיליטור (מטור). בהתאם למכשיר, ניתן לדווח על לחץ ב- mtorr, mbar, Pascal או & quotinches Hg & quot על מד ואקום. לעיון, 100 מטר = 0.133 mbar = 13.3 פסקל = 29.9 & quot Hg = 0.000132 אטם = 99.99% ואקום.

לאחר שהוואקום נמוך מ -200 מטר, יש להגדיל את טמפרטורת המדף לייבוש ראשוני, השלב הקשור לסובלימציה של מים. הטמפרטורה של המדף תלויה במדיום הליופליזציה. עבור סוכרוז, שמור על טמפרטורת המדף ב -25 & degC. עבור מאגר ריאגנט 18 או מאגר ייבוש הקפאה מיקרוביאליים, המדף יכול להיות גבוה עד -15 & degC בכל מקרה, ככל שההפרש בטמפרטורה בין המדף למלכודת הקרח/הקרח יהיה גבוה יותר, כך תהליך הייבוש העיקרי יהיה יעיל יותר.

אם מתרחשת התכה של הדגימות, ייתכן שיהיה צורך לקבוע אמפירית טמפרטורת מדף. אמצעי מעשי לעשות זאת כרוך בהצבת דגימה של המדיום הליופרוטקטיבי על מדף והורדה הדרגתית של הטמפרטורה כל 15 דקות. בשלב מסוים המדגם קופא. תחת ואקום עם מלכודת קור, המדגם שלך יהיה בטוח ויישאר קפוא. זוהי שיטה מעשית ובהחלט אינה בהכרח טמפרטורת הייבוש הראשונית היעילה ביותר, אך היא אמורה לפעול מספיק טוב.

ייבוש ראשוני הוא השלב הארוך ביותר של תהליך ייבוש ההקפאה. הרעיון הוא לשמור על המדגם קר יותר ממעבה (או מלכודת קרח) אך עדיין חם מספיק כך שהמים יעלו במהירות. ניתן להעלות את הטמפרטורה של המדף אל מעל לטמפרטורת ההיתוך כל עוד תהליך הסובלימציה מסיר את החום הזורם לדגימה מספיק מהר כדי למנוע התכה והתמוטטות מדגם (שם המטריצה ​​ממש נפרדת). הזמן לייבוש ראשוני יהיה תלוי גם בנפח המדגם. עבור חיידקים, הדגימות לעיתים רחוקות צריכות להיות גדולות ובדרך כלל הן 0.25 עד 0.5 מ"ל. ניתן להשלים מספר מוגבל של דגימות (10-20) במייבש מדפים תוך מספר שעות בלבד. מייבש מלא עם כמה מאות דוגמאות ייקח יותר זמן. באופן בטוח, תקופת ייבוש ראשונית שהיא לילה אמורה לפעול, אך בדוק זאת תחילה לפני שתנסה להקפיא מספר רב של בקבוקונים. כמדריך סטנדרטי, הקפיא למשך הלילה.

הדגימות עדיין מכילות לחות לאחר הייבוש הראשוני. על הסכום ניתן להתווכח, אבל הוא איפשהו בין 2 ל -4%. יש להפחית את רמת הלחות הזו וזה נעשה על ידי שאיבת חום לתוך המדגם במהלך שלב הייבוש המשני. שלב זה הוא קצר יחסית, נמשך שעה עד שעתיים, אך חשוב לכדאיות לטווח ארוך. עם זאת, ייבוש יתר של החיידקים עלול להזיק גם כן. שוב, בהתבסס על הייחודיות של הלופיליזר והדגימות שלך, יש לקבוע את הזמן האידיאלי לייבוש משני בניסוי. באופן כללי, להעלות את טמפרטורת המדף ל 20 & degC ולייבש במשך שעתיים.

כשהואקום במקום, עצרו את הבקבוקונים בעזרת צלחת/מנגנון העצירה. שחרר את הוואקום, הסר את הבקבוקונים ואבטח עוד יותר את פקקי הגומי/הפקקים בעזרת אטמי כיווץ לסכל. עדיף לאחסן את הבקבוקונים ב 4 & degC בחושך.

בדוק את הכדאיות של החיידקים המיובשים בהקפאה בהשוואה לתרבות המקורית (ראה קישור). בנוסף, עקוב אחר היציבות/הכדאיות של התרבויות המיובשות בהקפאה על ידי בדיקה ב 30, 90, 180 ו 365 ימים. פרוטוקול טוב יניב כמעט 100% תאים קיימא. כל דבר מעל 50% נחשב למקובל על ידי מעבדות רבות. חלב רזה יניב 10-20%. עם זאת, % קיימא לאחר ייבוש הקפאה אינו חשוב כמו המספר הכדאי לאחר האחסון. אם הכדאיות מתחילה לרדת במהירות ביומן או יותר לחודש, סביר להניח שיש צורך בפרוטוקול. שים לב שכמה זנים פשוט מאוד קפואים להקפיא ולא משנה מה, הם עלולים למות במהירות לאחר הליופליזציה.

ייבוש בהקפאה בעזרת סעפת

לאחר שחיידקים חולקו לבקבוקונים או צינורות, הקפיאו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס או שווה ערך. הקפאת פלאש יכולה להתבצע באמבט קרח/אתנול יבש, אך דגימות כאלה נוטות להתייבש לאט יותר. שמור את הדגימות קפואות (השתמש בקרח יבש במידת הצורך) עד שהן מחוברות לסעף.

הפעל את מכשיר הליופילייזר והמלכודת/הקרה. יש לכבות את שסתומי הסעפת ולהפעיל את הוואקום. אפשר לאקום לרדת עד 200 מטר או פחות.

חבר בצורה יעילה בקבוקון/צינורית לעצם ופתח את השסתום. הוואקום יתחיל מיד בתהליך הסובלימציה וימשוך חום מהדגימה. בתורו, חבר את הדגימות הנותרות. הוואקום יגדל בכל פעם שסתום פתוח, אך הוא צריך להתחיל לרדת באופן מיידי. אם הוואקום לא יירד לאחר הצמדת צינור, עלולה להיות דליפה בחיבור זה ובכך לסגור את השסתום ולהמשיך לשאר.

ייבוש הקפאה בעזרת סעפת מסתמך על חום הסביבה כדי להניע את סובלימציה של המים. ככל שהמים הזמינים יורדים, הטמפרטורה תטפס בהדרגה לסביבה. זה עשוי להימשך 2-3 שעות. לעתים קרובות כפור שנוצר בצד החיצוני של הצינורות יתפוגג לאחר ביצוע הדגימה.

בעזרת לפיד אצטילן (פרופאן יעבוד אבל זה לוקח יותר זמן) לאטום כל בקבוקון או צינור. הרכיבו משקפי בטיחות כדי להגן על העיניים מפני ניפוץ זכוכית וכפפות (כגון כפפות גינון מכותנה) כדי להגן על הידיים מפני הזכוכית החמה.

יש לאחסן בקבוקונים אטומים ב 4 & degC בחושך.

בדוק את הכדאיות של החיידקים המיובשים בהקפאה בהשוואה לתרבות המקורית (ראה קישור). בנוסף, עקוב אחר היציבות/הכדאיות של התרבויות המיובשות בהקפאה על ידי בדיקה ב 30, 90, 180 ו 365 ימים. אם הכדאיות מתחילה לרדת במהירות, כנראה שיש צורך בפרוטוקול.


לפני שתתחיל בתהליך, חשוב שתשמור על סטנדרטים גבוהים של ניקיון, במיוחד בעת הכנת תרבויות האם, בדומה לזה שאתה מכין את הגבינה שלך.

תרבות אם היא תרבות החיידקים הבסיסית ממנה תצייר דגימות לשימוש בפרויקטים הבאים להכנת גבינות.

  • לעקר צנצנת שימור ומכסה על ידי הרתחתם במים למשך כ -5 דקות או לנקות אותם ולאחר מכן להכניס אותם לתנור בחום של 300 מעלות פרנהייט למשך 15 דקות.
  • מצננים את הצנצנת ואז ממלאים אותה בחלב רזה, טרור מפוסטר, ומשאיר שטח של חצי סנטימטר.
  • סוגרים היטב את המכסה.
  • מניחים את הצנצנת בסיר עמוק כשגובה המים ½ אינץ 'מעל מכסה הצנצנת.
  • מביאים את המים בסיר לרתיחה ואז משאירים אותם לרתיחה איטית למשך 30 דקות.
  • הסר את הצנצנת מהמים ותן לה להתקרר עד 75 מעלות פרנהייט.
  • הוסיפו לחלב את הכמות המתאימה של תרבות המתנע המזופילית מיובשת בהקפאה (בהתאם להוראות היצרן) כשהיא עדיין בחום של 75 מעלות פרנהייט.
  • סוגרים שוב את המכסה היטב וסוחבים בעדינות את הצנצנת כדי לערבב את התרבות לתוך החלב.
  • מניחים את הצנצנת במקום כלשהו שישאיר את החלב על 75 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות.
  • לאחר כ -18 שעות אתה אמור לראות ג'ל לבן מוצק שנוצר. אם לא, השאירו אותו זמן רב יותר, או הניחו את הצנצנת במקום חם יותר לעידוד הקרישה.
  • כשהתרבות מוכנה היא צריכה להיראות כמו יוגורט סמיך. הוא יתרחק מצדי הצנצנת בצורה נקייה ויש לו משטח מבריק.

סוגי תרבויות מזופיליות ושימושיהן

טָרִי גבינה תַרְבּוּת:

תרבות מזופילית ארומטית המשמשת להכנת גבינות רכות כמו נויפצ'טל, צ'בר וגבינת קוטג '. ניתן להשתמש בתרבות זו גם להכנת סוגי גבינות מיושנות בטעם כגון בייבי סוויס וגבינה כחולה.

פלורה דניקה תרבות מתחילה מסופית:

משמשים לתת לגבינות טעם של חמאה. תרבות החיידקים משמשת בעיקר לייצור גבינות כמו אדאם, גאודה, לארדאם, סמסו וסוגים אחרים של גבינות רכות כמו קממבר וגבינה כחולה.

תרבות ישירה-מסופית:

תרבות גבינות רב תכליתית שניתן לייצר גבינות חצי רכות וטריות בבית. אתה יכול להשתמש בתרבות זו להכנת גבינות כמו מונטריי ג'ק, קולבי, צ'דר, צ'בר, פטה ועוד.

סוג ארומטי מסופילי:

תרבות גבינות רב תכליתית המשמשת לייצור גבינות חמאה וטעימות. תרבות מסוג זה משמשת בעיקר להכנת גבינות רכות כגון גבינת שמנת, גבינת עיזים וגבינת קוטג '. אתה יכול גם להכין שמנת חמוצה וחמאה מתורבתת בין גבינות מיוחדות אחרות כמו קממבר והברטי.

תרבות המתחילים מסדרת MM:

משמש להכנת גבינות בעלות מרקם פתוח, כגון ברי, האברטי, קממבר, גאודה, אדם, פטה, גבינה כחולה ושבר.

תרבות גבינה RA22:

תרבות חיידקים מחמצת מהירה המשמשת לייצור צ'דר מסורתי וגבינות דומות.

תרבות סדרת MA 4000:

תרבות זו מכילה חיידקים הדומים למאזן החיידקים בחלב נא. תרבות זו יוצרת מרקם פתוח האידיאלי לסוגים רבים של גבינות הכוללות גבינת ברין ד'אמור, קרפילי וגבינת רוקפור.


כיצד לדגור תרבות מיובשת בהקפאה? - ביולוגיה

BOCES תוכנית ליקויי שמיעה בדרום ווסטצ'סטר

תיכון ריי ברוק, ריי ברוק, ניו יורק

אילו חומרי ניקוי או סבונים ביתיים עובדים הכי טוב נגד חיידקים?

פעילות מעבדה זו היא לבדוק את האפקטיביות של מוצרי ניקוי ביתיים או סבונים שונים ביכולתם האנטיבקטריאלית. כל זן לא פתוגני של חיידק נפוץ, כגון אי - קולי יכול לשמש. מעבדה זו תדרוש מהתלמידים עבודת צוות, מחקר ופתרון בעיות.

מורים יכולים לבחור להשתמש בחלק מהחלקים של מעבדה זו או בכולם. ייתכן שתרצה לבקש מהתלמידים שלך לחקור אילו מיני חיידקים נמצאים בדרך כלל בבית. חלק 2 של הפעילות כולל הדגמה ותרגול של טכניקות טיפול סטריליות. בנוסף, התלמידים יעבדו בקבוצות כדי לכתוב את הנהלים כיצד הם מתכננים לבצע את המעבדה. לאחר עבודה בקבוצות קטנות, הכיתה תתכנס ותציע רעיונות לקביעת ההליכים המתאימים והמבוקרים ביותר. ככלל, על המעמד להסכים על מערך נהלים המשלב את הרעיונות הטובים ביותר מהקבוצות הקטנות. חלק 3 יהיה ביצוע הניסוי בפועל, איסוף נתונים, הצגת תוצאות וגיבוש מסקנה. חלק 4 מספק הצעות להערכת הפעילות ורעיונות להרחבות.

בעיות יישום עשויות לכלול בחירת זן ביתי מייצג מתאים של חיידקים. בנוסף, מכיוון שחיידקים נשלחים לעיתים קרובות מיובשים בהקפאה בצורת גלולה, יהיה צורך לקבוע את טימטר החיידקים במדיה שלו לפני הניסוי. סטודנטים מתקדמים עשויים לרצות לנסות זאת בעצמם בעזרת הדרכת מורים. יתכן גם שיהיה קשה לקבוע כמה כמות הכימיקל הביתי צריכה להיעשות. יש להתייחס לכך במהלך דיון ההליכים עם כל הכיתה. אצטרך רק חלק מכספי השיפור שלי לניסוי זה כדי לכסות את עלויות החממה, פיפטות, צלחות אגר, הספינר לפיזור צלחות באופן שווה והחיידקים.

חיידקים הם חלק מממלכת המונרה, שמשמעותה בהגדרה שהם חד תאיים וחסר גרעין. [9-12 תוכן תוכן C - התא] הם חיים באוכלוסיות מעורבות כמעט בכל מקום. התבוננות בדגימת חיידק מבודדת אחת שאינה מזוהמת עם מיקרואורגניזמים אחרים עלולה להיות בעייתית. בדיוק כמו כל היצורים החיים, כל סוג של חיידקים קיים בצורה הטובה ביותר בתנאי טמפרטורה ותנאי מזון ספציפיים. [9-12 תקן תוכן C - תלות הדדית של אורגניזמים] בתנאים הנכונים, חיידקים יתרבו במהירות רבה, לפעמים יכפילו את מספרם כל 20 דקות. כדי להילחם בהתפשטות חיידקים ווירוסים, חברות רבות משווקות כיום חומרי ניקוי וסבונים אנטיבקטריאליים או מחטאים. חומרי חיטוי משתמשים לעתים קרובות במוצרי אקונומיקה או אמוניה וחומרי חיטוי מוסיפים טריקלוזן. [9-12 תקן תוכן E - הבנות על מדע וטכנולוגיה]

מטרותיה של מעבדה זו כוללות:

למד טכניקות טיפול סטריליות לחיידקים

השווה את ההשפעות של חומרי ניקוי שונים על גדילת החיידקים

עיצוב ניסוי מבוקר

תרבות חיידקים בתנאי הגידול המתאימים

תרבית מיובשת בהקפאה חיידקית של לא פתוגנית אי - קולי

פיפטות חד פעמיות סטריליות

מוצרי ניקוי או סבונים שונים

[תקן הוראה D - הנגשת חומרי מדע נגישים]

חלק 1: טכניקות טיפול סטריליות

בעת הטיפול בחיידקים, חשוב שהתרבויות שלך לא יידבקו במונרנים או בפטריות אחרות הקיימות בדרך כלל בסביבתנו. לוחות האגר התומכים בצמיחת החיידקים שבחרתם מספקים בית גידול נפלא לחיידקים ופטריות אחרים. חשוב שתגן על הצלחות והתרבויות שלך מאורגניזמים אחרים בחדר. בנוסף, חיידקים רבים עלולים לגרום לך נזק. עליך להבין ולהדגים כיצד להתמודד עם אורגניזמים אלה בבטחה ככל האפשר. [תקן הוראה D - הקפדה על סביבת עבודה בטוחה]

יודגמו מספר טכניקות פשוטות. עבור כל אחד, כתוב סיכום קצר של השיטה ומשמעותה לשמירה על הניסוי שלך חופשי ככל האפשר ממזהמים.

להבות את הכובעים לכל הבקבוקים או הצינורות:

שמור את מנת האגר שלך סגורה ככל האפשר:

החזק כובעים באותה היד שבה אתה מחזיק מבחנות (אל תניח כובעים על השולחן):

שנה פיפטות (או טיפים) במידת הצורך:

מתי הכפפות כפופות או כבויות? האם אתה יכול לזהם את הכיתה שלך?

כיצד תוכל להימנע מסכנת עצמך בתרבויות חיידקים כלשהן?

סקירה כללית של הניסוי:

חייבים לשחזר את הגלולה המיובשת בהקפאה בתקשורת (פעל לפי ההנחיות)

כמה חיידקים חייבים לשים על הצלחת ולהתפשט באופן שווה

יש לרסס/לפזר חלק מהמנקה שלך על הצלחת

התרבויות יודגרו לזמן מוגדר והמושבות ייספרו

עם השותף או הקבוצה שלך במעבדה, סיעור מוחות על הרעיונות שלך כיצד תנהל את המעבדה הזו. עליך לכלול ולזהות את הפקדים התלויים והבלתי תלויים שלך, כמו גם כמויות ספציפיות של כל חומר ניקוי בו אתה משתמש. כתוב בצורה ברורה כדי שתלמיד אחר שאינו בקבוצה שלך יבין את ההנחיות שלך. [9-12 תקן תוכן א ' - עיצוב וביצוע חקירה מדעית]

לאחר דיון, אלה הנהלים המוסכמים שכולם ינהלו: [תקן הוראה ב '-תזמור שיח מדעי]


תרבות קפיר לא מעוברת מיובשת בהקפאה בייצור סיידר

התכתבות עם: A Nikolaou, מעבדה למיקרוביולוגיה שימושית וביוטכנולוגיה, המחלקה לביולוגיה מולקולרית וגנטיקה, אוניברסיטת דמוקריטוס בתראקיה, אלכסנדרופוליס GR-68100, יוון. דואר אלקטרוני: [email protected] חפש מסמכים נוספים מאת מחבר זה

המעבדה למיקרוביולוגיה שימושית וביוטכנולוגיה, המחלקה לביולוגיה מולקולרית וגנטיקה, אוניברסיטת דמוקריטוס בתראקיה, אלכסנדרופוליס, יוון

קבוצת ביוטכנולוגיה של מזון, המדור לכימיה אנליטית סביבתית ושימושית, המחלקה לכימיה, אוניברסיטת פטראס, פטראס, יוון

המעבדה למיקרוביולוגיה שימושית וביוטכנולוגיה, המחלקה לביולוגיה מולקולרית וגנטיקה, אוניברסיטת דמוקריטוס בתראקיה, אלכסנדרופוליס, יוון

המעבדה למיקרוביולוגיה שימושית וביוטכנולוגיה, המחלקה לביולוגיה מולקולרית וגנטיקה, אוניברסיטת דמוקריטוס בתראקיה, אלכסנדרופוליס, יוון

התכתבות עם: A Nikolaou, מעבדה למיקרוביולוגיה שימושית וביוטכנולוגיה, המחלקה לביולוגיה מולקולרית וגנטיקה, אוניברסיטת דמוקריטוס בתראקיה, אלכסנדרופוליס GR-68100, יוון. דואר אלקטרוני: [email protected] חפש מסמכים נוספים מאת מחבר זה

המעבדה למיקרוביולוגיה שימושית וביוטכנולוגיה, המחלקה לביולוגיה מולקולרית וגנטיקה, אוניברסיטת דמוקריטוס בתראקיה, אלכסנדרופוליס, יוון

קבוצת ביוטכנולוגיה של מזון, המדור לכימיה אנליטית סביבתית ושימושית, המחלקה לכימיה, אוניברסיטת פטראס, פטראס, יוון

המעבדה למיקרוביולוגיה שימושית וביוטכנולוגיה, המחלקה לביולוגיה מולקולרית וגנטיקה, אוניברסיטת דמוקריטוס בתראקיה, אלכסנדרופוליס, יוון

תַקצִיר

רקע כללי

מטרת המחקר הנוכחי הייתה להעריך את יעילות התסיסה של תרבות הקפיר המנותקת מיובשת בהקפאה על תומכים טבעיים (חתיכות תפוחים, חומר תאית מובהק) בייצור סיידר בטמפרטורות שונות (5-45 מעלות צלזיוס) בהשוואה לחופשי מיובשים בהקפאה. תאים. תאים מיובשים בהקפאה נבדקו בתחילה בתסיסי מיץ תפוחים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוערכו התרבויות המיובשות בהקפאה המיוצרות ללא קריופרוטקנטים בתסיסות אצווה חוזרות.

תוצאות

תסיסה חוזר ונשנית נמשכה יותר מחמישה חודשים. שיעורי המרה גבוהים של חומצת מאלית (עד 78.5%) וערכי פריון אתנול (עד 37.9 גרם ליטר -1 ביום -1) נרשמו עבור תאים משותקים מיובשים בהקפאה. תגובת שרשרת פולימראז-גילוי אלקטרופורזה של ג'ל שיפוע (PCR-DGGE) הראה שלייבוש הקפאה לא הייתה השפעה על המגוון החיידקי של תרבות הקפיר. אלכוהול גבוה יותר הופחת באופן משמעותי בטמפרטורות תסיסה נמוכות. יישום ניתוח המרכיבים העיקריים (PCA) גילה כי גם טמפרטורת התסיסה וגם אופי תרבות הקפיר המיובשת השפיעו באופן משמעותי על התנודתיות הקטנות שנקבעו על ידי כרומטוגרפיה של גז/ספקטרומטריית מסה (GC/MS). יש לציין כי כל הסיידרים המיוצרים היו באיכות גבוהה והתקבלו על ידי לוח הטעימות.

מסקנות

נמצא כי תרבית קפיר לא מקובלת מיובשת על תומכים טבעיים ללא קריופרוטקנטים מתאימה לתסיסת סיידר אלכוהולי ואלולקטי בו זמנית בטמפרטורות שונות (5-45 מעלות צלזיוס). היציבות התפעולית הגבוהה של המערכות אושרה והתוצאות המתקבלות מעניינות מאוד את המגזר התעשייתי מכיוון שניתן לנצל אותן לייצור סיידר, סיידר דל אלכוהול או ייצור סיידר 'רך'. © 2020 החברה לתעשייה כימית


מיצוי וטיהור פוליפנולים מאבקת ברי מיובשת בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים בכלי הדם. בַּמַבחֵנָה

עבודה זו מפרטת שיטה מפורטת להכנת תמציות עשירות בפוליפנול מאבקת פירות יער מוקפאים. בנוסף, הוא מספק תיאור יסודי של אופן השימוש בתמציות עשירות בפוליפנול בתרבית תאים בנוכחות הורמון הפפטיד אנגיוטנסין II (אנג II) באמצעות תאי שריר חלקים (VSMC).

תַקצִיר

מחקרים אפידמיולוגיים מצביעים על כך שצריכה מוגברת של פלבנואידים מתאימה לירידה בתמותה עקב מחלות לב וכלי דם (CVD) בארצות הברית (ארה"ב) ובאירופה. פירות יער נצרכים באופן נרחב בארה"ב ובעלי תכולת פוליפנולית גבוהה. הוכח כי פוליפנולים מקיימים אינטראקציה עם מטרות מולקולריות רבות ומפעילים תפקודים ביולוגיים חיוביים רבים, כולל השפעות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות וקרדיו-הגנה. פוליפנולים המבודדים מאוכמניות (BL), פטל (RB) ופטל שחור (BRB) מפחיתים מתח חמצוני והזדקנות סלולרית בתגובה לאנגיוטנסין II (אנג II). עבודה זו מספקת תיאור מפורט של הפרוטוקול המשמש להכנת תמציות פוליפנול מפירות יער מוקפאים. Polyphenol extractions from freeze-dried berry powder were performed using 80% aqueous ethanol and an ultrasonic-assisted extraction method. The crude extract was further purified and fractionated using chloroform and ethyl acetate, respectively. The effects of both crude and purified extracts were tested on Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) in culture.

מבוא

Polyphenols are compounds containing at least one phenolic ring in their structure and are abundantly present in the plant kingdom 1 . Humans have been consuming plants for millennia for medicinal purposes without being aware of the existence of such compounds 2 . Many fruits and vegetables have some shared polyphenolic compounds, albeit with different quantities, including flavonoids, stilbenes, and phenolic acids 3 . Although polyphenols are often associated with colorful fruits and vegetables, this is not strictly true. For example, zeaxanthin and xanthine are present in vegetables that are not highly colorful, such as onions and garlic, which are from the family of scallions and are associated with numerous health benefits 4 . Aside from being associated with several health benefits 5 , polyphenols also serve plants by protecting them from insects and ultraviolet radiation 2 . Polyphenols are commonly found in the human diet and are considered powerful antioxidants, as they can scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) 6 , 7 , 8 . They also have anti-inflammatory 9 , antimicrobial 10 , anti-hypertensive 11 , and anti-carcinogenic 12 , 13 properties.

Epidemiological studies demonstrate an inverse association between the consumption of flavonoids and cardiovascular disease (CVD) incidence 16 , 17 and mortality 14 , 15 . Berries are widely consumed in the US and have high amounts of polyphenols, including flavonoids. For instance, consumption of blackberry (BL) juice (300 mL/d) for eight weeks significantly decreased systolic blood pressure in dyslipidemic patients 18 . Jeong ואח '. 19 reported that pre-hypertensive men and women consuming 2.5 g of black raspberry (BRB) extract per day had lower 24-h and nighttime blood pressure compared to those consuming a placebo. Raspberries (RB) decreased blood pressure while increasing the expression of superoxide dismutase (SOD) in spontaneously hypertensive rats 20 . It has recently been shown that BL, RB, and BRB reduce the levels of ROS and senescence induced by angiotensin II (Ang II) in Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) 21 . In addition, the anthocyanin fraction from BL extract reduced the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and inhibited the activity of Nuclear Factor kappa B (NF-κB) and extracellular signal-regulated kinase (ERK) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated J774 cells 22 . BRB extracts decreased the NF-κB activation and cyclooxygenase 2 (COX-2) expression בַּמַבחֵנָה 23 , improved the lipid profile, and prevented atherosclerosis lesion formation in mice fed a high-fat diet 24 . Anthocyanins, which are considered the most abundant flavonoids in berries, modulate the inflammatory response in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages by decreasing Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) production 25 and decrease the proliferation and migration of VSMCs 26 .

Since there has been growing interest in understanding the role of polyphenols in human health and disease, it is important to optimize the extraction method. Solvent extraction is widely used for that purpose, as it is cost-effective and easily reproducible. In this study, a solvent extraction was used with ethanol, along with an ultrasonic-assisted extraction method, which was adapted from Kim and Lee 27 . The purification and fractionation of crude extracts (CE) using chloroform and ethyl acetate were performed to obtain the purified extract (PE) fraction that was adapted from Queires ואח ' 28. Furthermore, the efficacy of crude versus purified polyphenol extracts from BL at reducing the basal phosphorylation of ERK1/2 were compared, and representative examples of the inhibitory effect of purified BL polyphenol extract on Ang II-induced signaling reductions in VSMCs were provided.

נדרש מנוי. אנא המלץ על JoVE לספרנית שלך.

נוהל

1. Preparation of Reagents

  1. Prepare 80% ethanol (100 mL) by mixing 80 mL of absolute ethanol (molecular biology-grade) and 20 mL of cell culture-grade sterile water.
  2. To prepare polyphenol extract (10 mg/mL), weigh 10 mg of CE or PE. Add 1 mL of plain Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) under a cell culture hood. Vortex the solution. Aliquot in 200-µL portions and store at -20 °C.
  3. Prepare lysis buffer.
    1. Add 5 mL of 1 M HEPES stock solution (pH 7.4 50 mM final), 1 mL of 5 M NaCl stock solution (50 mM final), 1 mL of 0.5 M EDTA stock solution (5 mM final), 2 mL of 0.5 M NaF stock solution (10 mM final), 286 µL of 700 mM Na3VO4 stock solution (2 mM final), 5 mL of 200 mM Na4פ2או7 stock solution (10 mM final), and 5 mL of 20% Triton-X-100 stock solution prepared in water (1% final). Add water to reach a volume of 100 mL. Keep at 4 °C.
    2. Add 10 µL/mL of protease inhibitor cocktail. Add fresh when the cells are ready for lysis.
    1. Add 31.25 mL of 2 M Tris stock solution (pH 6.8), 100 mL of glycerol, 50 mL of a 20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) solution prepared in water, and 50 mL of β-mercaptoethanol. Add water up to 250 mL. Keep at 4 °C.

    2. Preparation of Blackerry Extracts

    1. Preparation of crude extract from freeze-dried berry powder.
      1. Weigh 10 g of freeze-dried blackberry powder (or 5 g of fresh powder). If frozen fruit is used, cut it into very small pieces before starting the extraction.
      2. Mix the fruit powder with 100 mL of 80% aqueous ethanol in a 1 L round-bottom Erlenmeyer flask.
      3. Sonicate the mixture for 20 min at 42 kHz, 135 W using an ultrasonic bath at 25 °C, without any time interval in between. Perform the sonication with continuous nitrogen purging in subdued light. For frozen fruit, increase the incubation time to 4 h.
      4. Filter the mixture through a #2 filter paper using a chilled Buchner funnel with vacuum suction.
        NOTE: At the end of this step, residuals of the sample appear on the filter paper this is called filter cake.
      5. Rinse the filter cake with 50 mL of 100% ethanol. Save the filtrate and add the filter cake to a 1 L round-bottom flask containing 100 mL of 80% aqueous ethanol.
      6. Repeat the extraction process for the residue (steps 2.1.2 - 2.1.4).
      7. Combine the two filtrates into a round-bottom flask with an additional 50 mL of 80% aqueous ethanol.
        NOTE: The final volume should be approximately 300 mL.
      8. Use a rotary evaporator at 62 °C and 50 rpm to evaporate the solvent. Continue this process until the ethanol does not evaporate anymore.
        NOTE: This process takes approximately 45 min.
      9. Transfer the sample to a 50 mL conical tube. Evaporate the ethanol by injecting nitrogen gas at the top of the tube for 10 min.
        NOTE: This step is needed to ensure the complete evaporation of the ethanol. The volume of the sample at this step is approximately 20 mL.
      10. Freeze the sample at -80 °C for at least 24 h.
        NOTE: This step is needed to allow for a more efficient freeze-drying process.
      11. Freeze-dry the sample at -50 °C for approximately 8 h. Store the samples at -20 °C.
        NOTE: The freeze dryer creates a powerful vacuum at -50 °C inside the chamber to dry the samples but preserves most of the compounds, such as polyphenols.

      3. Treatment of VSMCs with Berry Extracts

      1. VSMCs culture.
        1. Isolate VSMCs from the thoracic aortas of Sprague-Dawley rats by performing an enzymatic digestion, as previously described 29 . Culture the VSMCs as described 29 .
        2. Prepare complete medium for the culture of VSMCs using DMEM containing 1 g/L glucose and supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, and 2 mM L-glutamine. Store the complete medium at 4 °C.
        1. To split the VSMCs, discard the culture medium and wash the cells twice with phosphate-buffered saline (PBS). Add 4 mL of PBS and 2 mL of trypsin EDTA 0.25%. Incubate the cells for 5 min at 37 °C in a CO2 incubator.
          1. Collect the cells, mix them with 2 mL of complete medium in a 15 mL centrifuge tube, and centrifuge at 1,100 × g for 5 min. Discard the supernatant and resuspend the cell pellet with 1 mL of PBS. Count the cells using a hemocytometer.
          2. Seed 50,000 VSMCs per well in 6-well culture plates and grow them in complete medium containing 10% FBS until they reach 90% confluency (about 3 d). Maintain the VSMCs at 37 °C in a humidified 5% CO2 incubator.
          1. After 24 h of starvation, add 100 nM Ang II. Replace the treatment medium with fresh CE, PE, or Ang II every 24 h for 3 d.
          1. Wash the treated cells twice in cold PBS and lyse them with 200 µL of lysis buffer on ice.
          2. Collect cell lysates using cell scrapers and transfer the lysates to 1.5 mL microcentrifuge tubes. Incubate the total cell lysates for 20 min on ice and vortex every 5 min.
          3. Sonicate the cell extracts with three bursts at 125 W for 10 s each, with a 2 s pause in between. Keep the samples on ice throughout the sonication.
          4. Measure the protein concentration using a protein assay reagent at 595 nm.
          5. Store the samples at -20 °C for analysis by Western blot.
          1. Mix equal amounts of protein (about 50 µg) from control non-treated and polyphenol-treated or Ang II-treated samples with lysis buffer to obtain a maximum total volume of 50 µL. Add 16 µL of a 4x Laemmli sample buffer. Heat the samples for 5 min at 75 °C.
          2. Separate the samples in 10% SDS-PAGE gels and transfer them to PDVF membranes at 10 V for 75 min in a semi-dry transfer system for Western blot analysis with specific antibodies.
          3. Block the membrane with 2% milk in TBS 0.05% Triton-X100 buffer (TBS-T) for 20 min.
          4. Remove the milk by washing the membrane at least three times with TBS (5 min each) and incubate with primary antibodies for 1 h at RT or O/N at 4 °C.
          5. Wash the membrane three times, 10 min each, with TBS-T and incubate with an HRP-linked secondary antibody for 45 min.
          6. Wash the membrane three times, 10 min each, with TBS-T and develop by enhanced chemiluminescence (ECL).

          נדרש מנוי. אנא המלץ על JoVE לספרנית שלך.

          תוצאות נציג

          It has been previously demonstrated that polyphenol extracts isolated from BL, RB, and BRB reduced the senescence of VSMCs in response to Ang II 21 . It has been shown that these purified polyphenol extracts modulate Ang II signaling by reducing the phosphorylation of Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK), and ERK1/2. BL prevents senescence by reducing the expression of the NADPH oxidase (Nox) 1, an enzyme that produces superoxide anions and is strongly upregulated by Ang II. In contrast, RB and BRB prevent senescence by a Nox1-independent mechanism, as they increase the expression of the antioxidant enzymes SOD1, SOD2, and glutathione peroxidase 1 (GPx-1). BL fails to increase SOD2 expression, while none of the extracts attenuate the downregulation of catalase by Ang II 21 . BL was focused on to determine whether the lack of effect of BL on SOD2 and catalase expression could be explained by a loss of polyphenol compounds during the purification process or by an inadequate concentration of a certain polyphenolic compound in the extract. VSMCs were incubated with 50-500 µg/mL CE (Figure 1A) or PE (Figure 1B) in medium containing 0.5% FBS for three days. Neither CE nor PE increased SOD2 or catalase levels at any of the concentrations tested. As a positive control, ERK1/2 phosphorylation was measured, and it was found that CE reduced the phosphorylation of this kinase at concentrations higher than 300 µg/mL. In contrast, PE was effective at about 100 µg/mL (Figure 1B). Low phosphorylation levels were observed at concentrations of 200-500 µg/mL. These data support the previous observation showing that 200 µg/mL BL PE is sufficient to reduce Ang II signaling 21 . These results suggest that higher concentrations of polyphenol compounds in PE, compared with CE, could explain the higher efficiency of this extract at reducing ERK1/2 phosphorylation. To test this idea, the polyphenol compositions of both extracts were compared. The identification and quantification of polyphenol compounds in CE was performed by HPLC, as previously described 21 (שולחן 1). 3-או-caffeoylquinic acid and quercetin were present at higher levels in PE compared to CE, while ferulic acid and rutin were found only in CE. Next, VSMCs were treated with 200 µg/mL BL PE for 24 h before the addition of 100 nM Ang II (Figure 1C). As previously reported 21 , the BL polyphenol extract reduced Ang II-induced ERK1/2 phosphorylation but demonstrated no effect on catalase and SOD2 expression.


          Figure 1: Blackberry Polyphenols Reduce Basal and Ang II-induced ERK1/2 Phosphorylation in VSMCs. VSMCs cultured in 10% FBS at about 90% confluency were incubated with 50 - 500 µg/mL BL Crude Extract (CE) (A), Purified Extract (PE) (ב), or 200 µg/mL PE (ג) in 0.5% FBS DMEM medium for 3 d. ג) After 24 h of incubation with BL PE, Ang II (100 nM) was added and the cells were incubated for 3 d. The medium, with fresh extracts and Ang II, was changed every day. The cells were then washed and lysed, and the total cell extracts were separated in 10% PAGE-SDS gels. Western blots were tested with rabbit antibodies against phosphorylated ERK1/2 (Thr 202/Tyr 204), ERK1/2, catalase, and SOD2 and mouse antibody against β-actin. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

          Analytes (ppm) PE לִספִירַת הַנוֹצרִים
          Phenolic acids
          gallic acid 243.5 321.9
          p-coumaric acid 32.9 46.5
          Ferulic acid - 236.5
          Chlorogenic acids
          3-O-caffeoylquinic acid 235.3 170.5
          4-O-caffeoylquinic acid 13 76.9
          5-O-caffeoylquinic acid 14.1 49.9
          FLAVONOIDS
          Flavonols
          Quercetin 95 24.5
          Flavanones
          Rutin - 37.8

          שולחן 1: Analysis of the Polyphenol Composition of Blackberry in Crude and Polyphenol-purified Extracts. Phenolic acids and flavonoids in Crude Extract (CE) and Purified Extract (PE) were analyzed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The concentration of analytes is expressed as ppm. The composition of polyphenols in BL PE was recently published 21 and added to the table to be compared to CE.

          נדרש מנוי. אנא המלץ על JoVE לספרנית שלך.

          דִיוּן

          Polyphenols isolated from berries contain distinct compositions. The ethanol-based extraction protocol described here allowed for the identification of different levels of phenolic acids and flavonoids present in crude and purified polyphenol extracts of BL (שולחן 1). CE was enriched in gallic acid, ferulic acid, 4-O-caffeoylquinic acid, and 5-O-caffeoylquinic acid. The purification process did not significantly alter the levels of gallic acid and p-coumaric acid. However, it increased the levels of 3-או-caffeoylquinic acid from 170.5 - 235.3 ppm and of quercetin from 24.5 - 95 ppm. In contrast, ferulic acid and rutin were lost during the purification of CE.

          The treatment of VSMCs with 50 - 500 µg/mL CE and PE showed that both extracts were effective in reducing the basal phosphorylation of ERK1/2. However, PE showed a stronger downregulation in the activity of this kinase at a lower concentration: 100 µg/mL for PE compared with 400 - 500 µg/mL for CE. These results may reflect the higher concentration of 3-או-caffeoylquinic acid or quercetin found in PE. The use of individual phenolic compounds in cells in culture is needed to identify the specific compound(s) responsible for the downreguation of ERK1/2 phosphorylation.

          The decreased activity of signaling kinases, including Akt, ERK1/2, and p38MAPK, caused by purified polyphenols isolated from BL, RB, and BRB 21 , as well as of ERK1/2 caused by BL CE, shown here, is in agreement with previous reports. For instance, polyphenol extracts isolated from blueberry decreased the tumor growth of mammary cancer cells, in part by reducing the activity of Akt and ERK1/2 30 . As mentioned before, these kinases are also involved in the induction of cellular senescence by Ang II 21 , suggesting that polyphenols from BL, RB, and BRB should reduce vascular aging and dysfunction associated with CVD.

          As we reported previously 21 , catalase and SOD2 expression were not upregulated by PE, even at concentrations as high as 500 µg/mL. Since CE was also ineffective at increasing catalase and SOD2 expression, these data suggest that the phenolic compounds lost during the purification protocol are not involved in the regulation of these antioxidant enzymes. These data also suggest that the purification protocol shown here effectively concentrated phenolic compounds relevant to the regulation of Ang II signaling, oxidative stress, and cellular senescence. For example, the Representative Results show that PE strongly downregulated Ang II-induced ERK1/2 phosphorylation. The assessment of the phosphorylation of this kinase is relevant because the inhibition of ERK1/2 activity prevented Ang II-induced cellular senescence 21 .

          In terms of modifications to previous protocols, a sonication was added here to increase the extraction yield for CE. Additionally, for the purification of polyphenols, instead of using a C18 Cartridge, as described by Kim and Lee 27 , a more traditional method from Queires ואח '. 28 was adopted here. A filtration step, using filter paper to remove impurities, was added to the purification of polyphenol section. In terms of limitations, the sonication and evaporation steps should be carefully monitored according to the type of instrument used, since the duration and temperature of the sonication and evaporation, are the critical steps in this protocol. The modifications added to this method resulted in the highest yield of polyphenols when compared to previous methods 27 , 28 used in our laboratory (data not shown), most likely because of the addition of a sonication step. As mentioned in the protocol section, this protocol can be used for freeze-dried powder from various berries, as well as for frozen fruits. This method has been successfully used to extract and purify polyphenols from raspberries and black raspberries 21 , as well as from blueberries and strawberries (data not shown). Thus, this method could be also used to extract polyphenols from other types of foods, including vegetables.

          In conclusion, this work details a fast, cost-effective, and easily reproducible method to isolate polyphenols from berries, which allows for the retention and concentration of compounds that are protective against oxidative stress in VSMCs.

          נדרש מנוי. אנא המלץ על JoVE לספרנית שלך.

          Disclosures

          למחברים אין מה לחשוף.

          הכרות

          This work was funded by the American Heart Association (14GRNT20180028) and the Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).


          A stable freeze-dried smallpox vaccine made in monolayer cultures of primary rabbit kidney cells

          Smallpox vaccine was made in monolayers of primary rabbit kidney cells. The seed virus used for the production of this vaccine was the same as used for the production of calf lymph so that the vaccine contained vaccinia virus with not more than one tissue culture passage. As to other aspects this vaccine also met the international requirements for safety, potency and stability. For the lyophilization of this tissue culture smallpox vaccine a number of stabilizers routinely used for the lyophilization of several products were tested. A highly stable vaccine was obtained with 5% peptone-5% sorbitol for both the tissue culture smallpox vaccine and the calf lymph and the addition of other stabilizers did not increase the stability. With the same combination of stabilizers and lyophilized tissue culture smallpox vaccine, whether the ampoules were sealed in vacuo or in nitrogen, turned out to be more stable than lyophilized calf lymph.

          Cell cultures from approximately 500 rabbits were tested for adventitious agents. No cytopathic changes were observed and no viruses or other micro-organisms were isolated.


          Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying

          The widespread application of therapeutic cells requires a successful stabilization of cells for the duration of transport and storage. Cryopreservation is currently considered the gold standard for the storage of active cells however, (freeze-) drying cells could enable higher shelf life stability at ambient temperatures and facilitate easier transport and storage.

          During (freeze-) drying, freezing, (primary and secondary) drying and also the reconstitution step pose the risk of potential cell damage. To prevent these damaging processes, a wide range of protecting excipients has emerged, which can be classified, according to their chemical affiliation, into sugars, macromolecules, polyols, antioxidants and chelating agents. As many excipients cannot easily permeate the cell membrane, researchers have established various techniques to introduce especially trehalose intracellularly, prior to drying.

          This review aims to summarize the main damaging mechanisms during (freeze-) drying and to introduce the most common excipients with further details on their stabilizing properties and process approaches for the intracellular loading of excipients. Additionally, we would like to briefly explain recently discovered advantages of drying microorganisms, sperm, platelets, red blood cells, and eukaryotic cells, paying particular attention to the drying technique and residual moisture content.


          Preserving Microbial Cultures: Top 5 Methods

          The following points highlight the top five methods of preserving microbial culture. The methods are: 1. Agar Slant Cultures 2. Agar Slant Culture Covered with Oil (Parafin Method) 3. Saline Suspension 4. Preservation at Very Low Temperature 5. Preservation by Drying in Vacuum 6. Preservation by Freeze Drying (Byophilization).

          Preserving Microbial Culture: Method # 1.

          Agar Slant Cultures:

          All microbiology laboratories preserve micro-organisms on agar slant. The slants are incubated for 24hr or more and are then stored in a refrigerator. These cultures are periodically transferred to fresh media. Time intervals at which the transfers are made which varies with the origin and condition of growth.

          Preserving Microbial Culture: שיטה # 2.

          Agar Slant Culture Covered with Oil (Parafin Method):

          The agar slants are inoculated and incubated until good growth appears. They are then covered with sterile mineral oil to a depth of 1 cm above the tip of slant surface. Transfers are made by removing a loop full of the growth, touching the loop to the glass surface to drain off excess oil, inoculating a fresh medium and then preserving the initial stock culture.

          This is a simple and most economical method of preserving bacteria and fungi where they remain viable for several years at room temperature. The layer of paraffin prevents dehydration of the medium and by ensuring an aerobic condition, the microorganism remain in dormant state.

          Preserving Microbial Culture: Method # 3.

          Saline Suspension:

          Sodium chloride in high concentration is frequently an inhibitor of bacterial growth. Bacteria are suspended in 1% salt solution (sublethal concentration in screw cap tubes to prevent evaporation). The tubes are stored at room temperature. Whenever needed the transfer is made on agar slant.

          Preserving Microbial Culture: Method # 4.

          Preservation at Very Low Temperature:

          The organisms are suspended in nutrient broth containing 15% glycerol. The suspension is frozen and stored at -15°C to -30°C. The availability of liquid nitrogen (temp -196°C) provides another main preserving stock culture. In this procedure culture are frozen with a protective agent (glycerol or dimethane sulphoxide) in sealed ampoules. The frozen culture are kept in liquid nitrogen refrigerator.

          Preserving Microbial Culture: Method # 5.

          Preservation by Drying in Vacuum:

          The organisms are dried over calcium chloride in vacuum and are stored in the refrigerator.

          Preserving Microbial Culture: Method # 6.

          Preservation by Freeze Drying (Byophilization):

          In this process the microbial suspension is placed in small vials. A thin film is frozen over the inside surface of the vial by rotating it in mixture of dry ice (solid carbon dioxide) and alcohol, or acetone at a temperature of −78 o C .The vials are immediately connected to a high vacuum line. This dries the organism while still frozen. Finally, the ampules are sealed off in a vacuum with small flame.

          These culture can be stored for several years at 40°C. This method is also employed for preservation of toxins, sera, enzymes and other biological material. To revive microbial cultures it is merely necessary to break open the vial aseptically, add a suitable stale medium, and after incubation make further transfers.

          The process permits the maintenance of longer number of culture without variation in characteristics of the culture and greatly reduces the danger of contamination.

          Depending on the chemical constituents from which they are made, their physical nature and their functions, different parameters of media are described here.


          צפו בסרטון: אודטה אצל פאולה וליאון - איך להאריך את חיי הירקות במקרר? מלפפונים,ירוקים,וחסה (יָנוּאָר 2022).