מֵידָע

מבנה ותפקוד חלבון תחזוקת המיניכרומוזום


אני מתקשה לענות על שלוש שאלות שיעורי בית הנוגעות ישירות לצ'ונג ואח '. (2000).

שאלות

המחברים קבעו כי MtMCM מסוגל לאגד הן ssDNA והן dsDNA (ראה איור 1). עם זאת, הם אינם מזכירים אם זה אותו אתר או אתר אחר בחלבון המעורב בכריכת שתי צורות ה- DNA.

שאלה 1: הציע ניסוי שיסייע להבחין בין שתי האפשרויות הללו לבין איזו תוצאה היית מצפה?

שאלה 2: אם ssDNA ו- dsDNA אכן חולקים את אותו אתר מחייב MtMCM, איזה חלק מה- DNA אתה מניח שהוא מעורב בגירוי פעילות ה- ATPase? במבחן helicase, המחברים מראים כי MtMCM יכול לעקור שברי ssDNA גדולים (עד 500 בסיסים) ממצע עגול (עמ '1533).

שאלה מס '3: הסבר מדוע זהו, או אינו, מבחן מתאים לתהליכי MtMCM?

התשובות שלי

שאלה 1:

שיטה אחת אפשרית לקבוע אם מתחם MtMCM משתמש בשני אתרים שונים כדי לקשור ssDNA ו- dsDNA היא באמצעות זיהוי וחסימה (כלומר באמצעות ליגנד) של אתר מחייב ספציפי יחיד ב- MtMCM. אם החסימה של אתר זה מונעת את קישור ה- MtMCM הן ל- ssDNA והן ל- dsDNA, הדבר יעיד כי אותו אתר משמש לשניהם. עבודת המחקר מצביעה על כך ש- ssDNA ו- dsDNA אכן חולקים את אותו אתר קישור מכיוון שקילציה של יוני מגנזיום מנעה מהחלבון להתחבר ל- DNA.

שאלה 2:

לא זוהתה הידרוליזה של ATP בתערובות תגובה המכילות את החלבונים המוטנטים K341E או דלתא-N, אולם חלבון wt ו- K341E עדיין יצרו קומפלקסים עם ה- DNA. אם ssDNA ו- dsDNA אכן חולקים את אותו אתר מחייב MtMCM, אז אולי זה החלק הדלתא-N של ה- DNA שמעורב בגירוי פעילות ה- ATPase.

שאלה 3:

התקשיתי להתחיל את השאלה הזו. זה מה שיש לי עד כה: זהו מבחן מתאים לתהליכי MtMCM מכיוון שנעשה שימוש באוכלוסיית מצעים בעלי גדילים נעים באורך הולך וגדל. זה איפשר לחוקרים להשוות את העקירה של הגדילים השונים ולכמת את התהליכות של מתחם ה- MCM.

הודע לי אם אני צריך לספק מידע נוסף. כל עזרה או הדרכה תתקבל בברכה!


חלבון תחזוקה של מיניכרומוזום

תחזוקת המיניכרומוזום (MCM) היא משפחה של שישה חלבונים (Mcm2–7, מסות מולקולריות של 101, 91, 97, 82, 93 ו -81 kDa בהתאמה) עם רצפי חומצות אמינו שמורים מאוד בין ששת הפוליפפטידים השונים. המשפחה זוהתה לראשונה במסך של חלבונים הנדרשים לתחזוקה של מיניכרומוזומים בשמרים. כל ששת החלבונים זוהו בכל האאוקריה. בהתבסס על מחקרים גנטיים וביוכימיים, מתחם ה- MCM נחשב להליקאזה האחראי להפרדת ה- DNA הדופלקס במהלך שכפול כרומוזומלי. כל חלבוני MCM חיוניים לכדאיות התא. הם נחוצים לשלב ההתחלה כמו גם להתקדמות מזלג השכפול. בנוסף ל- heterohexamer MCM, in vivo ו בַּמַבחֵנָה מחקרים חשפו את נוכחותם של מספר מתחמי MCM נוספים המורכבים משילובים שונים של חלבוני MCM. מחקרים ביוכימיים עם מתחמים שונים אלה מאורגניזמים שונים הראו זאת בַּמַבחֵנָה קומפלקס דימרי של הטרוטרימר Mcm4,6,7 הכיל פעילות של ה- Helicase DNA של 3'-5 ', ssDNA ו- DNA דו-גדילי (dsDNA), פעילות ATPase תלויית DNA, ויכולה להעביר טרנסלוקציה לאורך ssDNA ו- dsDNA ולפרוק DNA- RNA היברידי בעת טרנסלוקציה על גדיל ה- DNA. כמו כן, נמצא כי הטרוהקסאמר של Mcm2–7 מחזיק בפעילות ה- Helase 3 " - 5 'DNA בַּמַבחֵנָה, אך רק בנוכחות גורמי אביזר Cdc45 ומתחם GINS [המכונה קומפלקס CMG (Cdc45 – MCM – GINS)]. הוא האמין כי מתחם ה- CMG הוא ההליקאז הפעיל במזלג השכפול. כיוון הטרנסלוקציה של 3′–5 ′ על ה- DNA על ידי חלבוני MCM מציע כי ההליקאז נע לאורך הגדיל המוביל.


& ltp> סעיף זה מספק מידע שימושי על החלבון, בעיקר ביולוגיה. & ltp> & lta href = '/help/function_section' target = '_ top'> עוד. & lt/a> & lt/p> פונקציה i

הליקאז משוכפל לכאורה. בעל פעילויות ATPase ו- DNA helicase. האחרון ממיס עדיפות אוליגונוקלאוטידים בעלי זנב 5'ה ומגורה על ידי חלבון SSB (חלבון מחייב DNA חד גדילי). אתרי ה- ATPase הפעילים בטבעת ה- MCM נוצרים דרך משטחי האינטראקציה של שתי יחידות משנה שכנות כך שמבנה קריטי של מוטיב אצבע ארגינין שמור מסופק בטרנס ביחס לאתר מחייב ה- ATP של תיבת ווקר A של יחידת המשנה הסמוכה. פונקציית ההליקאז מוצעת להשתמש במצב עוקב חלקי של הידרוליזה ATP שהמתחם נראה סובל מספר יחידות משנה לא פעילות קטליטי.

& ltp> מידע שאוצר באופן ידני שעבורו יש עדויות ניסיוניות שפורסמו. & lt/p> & ltp> & lta href = "/manual/evidences#ECO: 0000269"> עוד. & lt/a> & lt/p> טענה ידנית המבוססת על ניסוי ב- i


מבנה ותפקוד חלבון תחזוקת המיניכרומוזום - ביולוגיה

תמונת מצב ניסיונית

  • שיטה: & nbspהפצת רנטגן
  • רזולוציה: & nbsp3.15 Å
  • ערך R חינם: & nbsp0.241 & nbsp
  • עבודה R-Value: & nbsp0.188 & nbsp
  • ערך R נצפה: & nbsp0.191 & nbsp

אימות wwPDB& nbsp & nbspדו"ח תלת -ממדי ודוח מלא

מנגנון טרנסלוקציית DNA של מכלול MCM והשלכות על התחלת שכפול.

(2019) Nat Commun & nbsp10: 3117-3117

  • PubMed: & nbsp31308367 & nbsp חיפוש ב- PubMed חפש ב- PubMed Central
  • DOI: & nbsp10.1038/s41467-019-11074-3
  • ציטוט ראשוני של מבנים קשורים: & nbsp
    6MII
  • PubMed מופשט: & nbsp

פעילות טרנסלוקציית ה- DNA של מכלול תחזוקת המיניכרומוזום (MCM) מעניקה הפרדת גדילים DNA של מזלגות השכפול של האקריוטים והארכאיים. כאן אנו ממחישים מנגנון ברמה האטומית לפעילות זו עם מבנה קריסטל של הקסאמר MCM ארכאי הקשור ל- DNA חד-גדילי וקופקטורים נוקלאוטיד.

פעילות טרנסלוקציית ה- DNA של מכלול תחזוקת המיניכרומוזום (MCM) מעניקה הפרדת גדילים DNA של מזלגות השכפול של האקריוטים והארכאיים. כאן אנו ממחישים מנגנון ברמה האטומית לפעילות זו עם מבנה קריסטל של הקסאמר MCM ארכאי הקשור ל- DNA חד-גדילי וקופקטורים נוקלאוטיד. שימור רצפים מצביע על מנגנון סיבובי זה אפשרי במלואו עבור כל האאוקריוטים והארכאים. המבנה מדגים באופן סופי את כיווני הטבעת במהלך טרנסלוקציה עם תחום ה- N-terminal המוביל, המציין כי פעילות הטרנסלוקציה יכולה גם לספק את הבסיס הפיזי של התחלת שכפול כאשר דו-הקסאמר כפול המקיף DNA כפול-גדילי הופך ל- hexamers יחיד המקיפים רק קווצה אחת. במנגנון זה, כל גדיל נקשר לשכבת ה- N-terminal של הקסאמר אחד ולדרגת AAA+ של ההקסאמר השני, כך שטבעת אחת מושכת את השנייה, ומיישרת ממשקים שווים כדי לאפשר לכל hexamer למשוך את קווצת הטרנסלוקציה שלו מחוץ להקסאמר הנגדי. .


תובנות מבניות ומכניסטיות לגבי הרכבה ותפקוד כפול-הקסאמר כפול של Mcm2-7

תאים אוקריוטיים נותנים רישיון לכל מוצא של שכפול DNA במהלך שלב G1 על ידי הרכבת קומפלקס קדם-רישום המכיל מק"מ 2-7 (חלבוני תחזוקה מיניכרומוזום 2-7) הקסאמר כפול. במהלך שלב S, כל הקסאמר Mcm2-7 מהווה את הליבה של מסוף ה- DNA המשכפל. עם זאת, מנגנוני רישוי המוצא והפעלת המסוקים אינם מובנים היטב. מעמיסי הליקאז ORC-Cdc6 פועלים לגיוס אחד מסוג Cdt1-Mcm2-7 heptamer למקורות שכפול לפני שחרור Cdt1 ויצירת מורכבים ORC-Cdc6-Mcm2-7, אך כיצד מגויס ה- hexmamer השני Mcm2-7 לקידום הקסאמר כפול היווצרות אינה מובנת היטב. כאן מדווחות עדויות מבניות למתווכים המורכבים ממתחם ORC-Cdc6-Mcm2-7 ומכלול ORC-Cdc6-Mcm2-7-Mcm2-7, המספקים יחד תובנות חדשות לגבי רישוי DNA. ניתוח מבני מפורט של מכלול ה- Mcm2-7 הכפול-הקסאמר הטעון מוכיח כי שני ההקסאמים משולבים ומכוונים לא נכון לאורך ציר ה- DNA וחסרים בפעילות הידרוליזה של ATP שחיונית לפעילות ה- helicase של ה- DNA. יתר על כן, אנו מראים שההרכבה ראש בראש של ההקסאמר הכפול Mcm2-7 יוצרת משטח אינטראקציה חלבוני חדש היוצר אתר רב-יחידות מחייב עבור קינאז חלבון S-Phase שידוע כי הוא מפעיל שכפול DNA. הנתונים מצביעים על אופן הרכבת ההקסאמר הכפול וכיצד מוסדרת פעילות ההליקאז במהלך רישוי ה- DNA, עם השלכות על השליטה במחזור התא של שכפול ה- DNA ויציבות הגנום.

מילות מפתח: ייזום שכפול DNA חניכת אלקטרונים מיקרוסקופיה זיהוי מוצא מורכב מראש הכפלה מורכבת משופרת.

© 2014 Sun et al. הוצאת הוצאת מעבדת קולד ספרינג הארבור.

דמויות

תהליך ההרכבה לפני השלבים לפני RC ...

תהליך ההרכבה לפני השלבים לפני RC והדמיה של EM של ביניים במהלך גיוס ...

מתקן טעינה חדש המכיל…

אמצעי טעינה חדש המכיל OCM אחד והקסמר אחד Mcm2–7. ( א…

שחזור תלת מימד של שישה MBP שהוכנסו…

שחזורים תלת-ממדיים של שישה הקסמרים כפולים הוכנסו ל- MBP2–7. ( א ) שניים נבחרים…

הארכיטקטורה של Mcm2–7…

הארכיטקטורה של הקסאמר הכפול Mcm2–7. ( א ) ארבע מבטים מהצד…

השלכות פונקציונליות של Mcm2–7…

השלכות פונקציונליות של מבנה ה- Mcm2–7 כפול-הקסאמר. ( א ) יש שני…

EM של ביניים לפני RC מציע ...

EM של מתווכים טרום RC מציע טעינה אפשרית של הליקאז ומנגנוני היתוך DNA ראשוניים. צעדים…


חלק ניסיוני

שיבוט

השיבוט בוצע מתוך DNA גנומי Pab (מתנה טובה של פ 'פורטר). הפריימרים oligo1 ו- oligo4 שימשו להגברת PCR של מסוף ה- N של MCM, הפריימרים oligo5 ו- oligo6 שימשו להגברת השבר Ser499-Leu525 והפריימרים oligo3 ו- oligo2 שימשו להגברת השבר C- מסוף של MCM ( טבלה משלימה 1). האורך המלא פאבMCM שוחזר בשלוש תגובות PCR (איור 1). בכל תגובה, ה- PCR לחיבור השברים בוצע בשני שלבים. בשלב הראשון הודגרו שני שברים בתערובת התגובה במשך 5 מחזורים, בהעדר פריימרים, על מנת למלא את קצות 5 '. בשלב השני נוספו פריימרים ובוצעה PCR במשך 35 מחזורים. ב- PCR הראשון, השבר המסוף N התמזג עם השבר Ser499-Leu525 ולאחר מכן הוגבר על ידי הצמד Oligo1 ו- Oligo6. ב- PCR השני, השבר Ser499-Leu525 התמזג עם השבר מסוף C של MCM ולאחר מכן הוגבר על ידי זוג האוליגוס 5 ו- 2. השבר המשוחזר באורך מלא משוכפל לתוך וקטור pET שונה והרצף היה אושר על ידי רצף.

ביטוי יתר של חלבון וטיהור

פאבMCM הביע ביטוי יתר ב- Rosetta (DE3) pLysS שגדל במרק נהדר (TB). תאים גדלו ל- Abs600 = 0.4-0.6 לפני האינדוקציה עם 0.2 מ"מ IPTG למשך 16 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. פאבMCM טוהר על ידי דינטורציה של חום (20 ′ ב 70 C), ואחריו כרומטוגרפיה של זיקה לניקל ושכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. שברים שחומקו משלב טיהור הזיקה לניקל נאספו ונבדקו על זיהומי DNA על ידי מדידת ה- ABS260/280 יַחַס. רק שברים עם Abs260/280 היחס בין 0.51 ל- 0.68 (99% חלבון) התרכזו על ידי סינון אולטרה באמצעות Vivaspin 15 R (30,000 MWCO), לריכוז סופי של 15 מ"ג/מ"ל. לבסוף, המדגם נטען על טור Superose6 TM 10/300 GL אי הכללה של כרומטוגרפיה. המשקל המולקולרי לכאורה של PabMCM, הנאמד באנדרוס 24, היה

Assay מחייב DNA

מבחני קישור DNA בוצעו כמתואר ב- ref. 25. אוליגוס 3 ו -4 הסתירו במאגר חישול (50 מ"מ טריס, 50 מ"מ NaCl, pH 8.8) לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. החישול הושג על ידי דגירה של הצינור המכיל את תערובת האוליגו בכוס עם מים רותחים והניחה לה להתקרר למשך הלילה. התגובות בוצעו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חישול נבדק על ידי אלקטרופורזה על ג'לים agarose 1.5%.

Assay Helicase

המצע בצורת Y הניגון מתקבל על ידי ערבוב אוליגו A ו- B (לוח משלים 2) כמתואר במבחן מחייב DNA ואחריו טיהור דף.

מבחני ההליקאז (20 μl) בוצעו על ידי ערבוב של 5 ננומטר בצורת Y בצורת פלורסנט, 10 מ"מ ATP, והגדלת כמויות האנזים במאגר התגובה המכיל 20 מ"מ טריס-אצטט pH 7.9, 50 מ"מ אשלגן-אצטט, 10 מ"מ מגנזיום-אצטט ו- 1 מ"מ DTT. תגובות נפתחו על ידי הוספת ATP, והתערובות הודגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. התגובות הופסקו על ידי תוספת של 11 μl של תמיסת עצירה צוננת (0.5 מ"ג/מ"ל Protéinase K, 0.5% [wt/vol] SDS, 5 מ"מ EDTA, ועודף טוחני פי 250 של מלכודת DNA לא מסומנת oligonucleotide C כדי למזער מחדש את האוליגנוקלאוטידים המפותלים. ואחריו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, מאגר טעינה של 4 μl מתווספים לדגימות. כבקרה חיובית, מצעי ה- DNA הופנמו בחום ב -95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בהעדר הליקאז. הבקרה, המצעים הודגרו בתערובת התגובה בהעדר Helicase. הדגימות נפתרו בג'ל פוליאקרילמיד 8% (vol/vol) ב- 1 × Tris-borate-EDTA. הלהקות המסומנות פלורסנט דמיינו באמצעות טייפון 9400 (GE שירותי בריאות) וכמת עם תוכנת ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics).

אלקטרון מיקרוסקופי

פאבMCM נחקר הן על ידי צביעה שלילית והן מיקרוסקופ אלקטרונים קריו (EM) וניתוח חלקיקים בודדים (SPA). דגימת החלבון נוספה לרשתות שזורקות זוהר, סופגו ונשטפו פעמיים לפני הצביעה באמצעות 1% אורניל אצטט. הנתונים נאספו על מיקרוסקופ FEI F20 FEG, המצויד במצלמת CCD של TemCam-F816 (8kx8k). תמונות נאספו במצב מינון נמוך בהגדלה נומינלית של 50,000x, בדגימה סופית של 1.51 Å/פיקסל ברמת הדגימה. תמונות חלקיק בודדות מוכתמות באופן שלילי נבחרו באופן אינטראקטיבי באמצעות התוכנית e2boxer.py מחבילת ניתוח חלקיקים בודדים של EMAN2 וחולצו לקופסאות. עיבוד התמונה בוצע באמצעות חבילות IMAGIC-5 45 ו- Eman 35,46. הנתונים נדגמו מחדש ב -6.04 Å/פיקסל.

45,000 תמונות עם צביעה הומוגנית סוננו פס-פס עם חיתוך מעבר גבוה של 110 Å וחתך מעבר נמוך של 18 Å. תמונות החלקיקים החדשות נותחו על ידי ניתוח סטטיסטי רב משתני עם IMAGIC-5. מערך הנתונים היה נתון לסיבובים רצופים של יישור וסיווג על מנת לשפר את ממוצעי המחלקה לתמונה שהתקבלו. שחזור תלת ממדי בוצע באמצעות פרוטוקולי Imagic ו- Eman2. המפה הופקדה ב- PDB עם קוד ההצטרפות EMD-3487. איסוף נתוני cryoEM בוצע על רשתות Quantifoil מכוסות בשכבה דקה של פחמן, שהוקפאו לתוך אתן נוזלי באמצעות מכשיר Vitrobot. איסוף הנתונים בוצע באותה הגדלה של מחקר הצביעה השלילית (50,000x) במצב במינון נמוך. ניתוח החלקיקים החדשים בוצע באמצעות תוכנת Relion 36 בהתאם להוראות. הנתונים הוכנו עם UCSF Chimera 38 ו- Pymol 47.


& ltp> סעיף זה מספק מידע שימושי על החלבון, בעיקר ביולוגיה. & ltp> & lta href = '/help/function_section' target = '_ top'> עוד. & lt/a> & lt/p> פונקציה i

פועל כמרכיב במכלול MCM2-7 (מתחם MCM) המהווה את ההליקאז המשוכפל המשוער החיוני ל"התחלה והארכה של "פעם אחת בכל מחזור התא". אתרי ה- ATPase הפעילים בטבעת MCM2-7 נוצרים דרך משטחי האינטראקציה של שתי יחידות משנה שכנות כך שמבנה קריטי של מוטיב אצבע ארגינין שמור מסופק בטרנס ביחס לאתר מחייב ה- ATP של תיבת ווקר A של הסמוך יחידת משנה. עם זאת, ששת האתרים הפעילים ב- ATPase עלולים לתרום באופן שונה לפעילות ההליקאז המורכבת במיוחד, איגוד MCM2-MCM5 מוצע להיות הפיך ולתווך קונפורמציה של טבעת פתוחה שעשויה להקל על העמסת DNA. לאחר הטעינה על ה- DNA, hexamers כפולים יכולים להחליק על dsDNA בהעדר פעילות ATPase.

& ltp> מידע שאוצר באופן ידני שעבורו יש עדויות ניסיוניות שפורסמו. & lt/p> & ltp> & lta href = "/manual/evidences#ECO: 0000269"> עוד. & lt/a> & lt/p> טענה ידנית המבוססת על ניסוי ב- i


תַקצִיר

שכפול בארכיאה מתבצע על ידי חלבונים שהם הומולוגים של עמיתים אוקריוטים. עם זאת, המערכות הארכאיות נוטות להיות הרבה יותר פשוטות עם פחות גנים שונים המקודדים את פונקציות הליבה מאשר אצל עמיתיהם האאוקריוטים. בארכאות רבות, קיים הומולוג של תחזוקת מינכרוזומים בודדת (MCM), הנחשבת להיות ההליקאז המשוכפל ובין אחד לשלושה הומולוגים מורכבים של זיהוי מוצא (ORC) המעורבים בקשר למקורות השכפול. כאן אנו מתארים את השיבוט והאפיון של חלבון ה- MCM מהקרנארכיאוטה Aeropyrum pernix. בדומה לחלבוני MCM אוקריוטים וארכאיים אחרים, הוא נמצא כ- helicase DNA תלוי ATP, ושאריות האתר הפעיל המשוער הקשורות לקשירת ATP והידרוליזה מאוששות על ידי מוטציה. מחיקת N-Terminal 256 חומצות אמינו הניבה חלבון בעל פעילות ATPase גבוהה יותר בהעדר DNA ושמרה על פעילות הלקאז חזקה. אינטראקציות עם חלבוני ORC של א פרניקס נבדקו ונמצא כי שני ההומולוגים של ORC יכולים לעכב את פעילות ההליקאז של MCM. יתר על כן, נמצא כי ORC2 יכול autophosphorylate בנוכחות ATP ועוד יותר להפליא יכול phosphorylate MCM באופן ספציפי מינים.


& ltp> סעיף זה מספק מידע שימושי על החלבון, בעיקר ביולוגיה. & ltp> & lta href = '/help/function_section' target = '_ top'> עוד. & lt/a> & lt/p> פונקציה i

נדרש לסינתזת DNA. נדרש לכניסה לשלב S או להשלמתו. מעורב בשכפול DNA ונראה שהוא משתתף בהפעלת מכלול הטרום-שכפול (טרום RC) ובהארכת שעתוק. עשוי לשחק תפקיד כרכז מפתח בהרכבת מזלג השכפול. מוצע לתפקד במקורות שכפול לאחר כריכת מתחם MCM2-7 לפני גיוס CDC45. כנראה נדרש כדי לעורר זרחון של מתחם MCM2-7 על ידי קומפלקס קינאז CDC7-DBF4. עשוי לגייס את מתחם ה- DNA פולימראז אלפא: פרימאז למקורות שכפול והוא נדרש לשמור אותו על כרומטין ללא תלות ב- CDC45. עשוי לשחק גם תפקיד בהשתקת תעתיק.

& ltp> מידע שאוצר באופן ידני שעבורו יש עדויות ניסיוניות שפורסמו. & lt/p> & ltp> & lta href = "/manual/evidences#ECO: 0000269"> עוד. & lt/a> & lt/p> טענה ידנית המבוססת על ניסוי ב- i


שער ב- MCM (2–7)

מחקרים עם מטוהרים Saccharomyces cerevisiae MCM (2-7) חשף כי דגירה מוקדמת של המתחם עם ATP או אנלוגי דל הידרוליזציה גרועה גרמה לפגיעה בהליקאז להיקשר לדנ"א מעגלי חד-גדילי סגור קוולנטי אך הייתה לו השפעה זניחה על יכולתו של המתחם לקשור DNA לינארי (בוכמן ושווצ'ה 2008). תוצאה זו העלתה כי יתכן וקיים שער ב- MCM שנסגר בנוכחות ATP, ובכך יכלול DNA טופולוגית מהנקבובית המרכזית של הטורויד. כפי שתואר לעיל, אתרי ה- ATPase של MCM נמצאים בין יחידות משנה, ולכן בוצעה סדרה של מחקרי מוטגנזה במטרה למקד ממשקים בודדים באופן שיטתי, מה שהופך אותם לבלתי מסוגלים לקשור ATP. למרבה הפלא, המוטציה של שארית ליזין מסוג Walker A מ- MCM5 או האצבע הארג'ינית של MCM2 הפכה את ה- MCM (2-7) לחסר רגישות ל- ATP בעת כריכת DNA חד-גדילי מעגלי. לפיכך, נראה כי הממשק בין MCM2 ל- MCM 5 משמש כשער מאופנן ב- ATP שדרכו ssDNA יכול לעבור (Bochman ו- Schwacha 2008). מסקנות אלה, שהופקו מניסויים ביוכימיים, קיבלו אישור מבני עם בירור שחזורי EM של רקומביננטי מטוהר. תסיסנית MCM (2-7). בדומה ל- MCM הארכיאלי, נצפה מבנה דו-שכבתי, המתאים לתחומים אמינו-מסופים ולתחומים AAA + (Costa et al. 2011). עם זאת, נצפו שתי קונפורמציות מובחנות של MCM (2-7). בצורה אחת נראה מבנה טבעת כמעט סימטרי שעדיין בעל חריץ ברמות AAA +. הצורה השנייה, והנפוצה יותר, הייתה בעלת חריץ אסימטרי או תצורת מכונת כביסה עם מפתח עם פתח הנמשך לכל אורך ה- MCM. בקונפורמציות אלה, יחידות המשנה הבודדות לא היו מישוריות וקיבלו טוויסט סלילי קל. ניסויים באמצעות MCM (2-7) עם יחידות משנה המתויגות בנפרד גילו שהפער נמצא בין MCM2 ל- MCM5 (Costa et al. 2011). עבודה נוספת המחישה את מבנה ה- תסיסנית מתחם CMG. זה חשף תצורה סימטרית יותר בצורת טבעת של ה- MCM שבו זוהתה אינטראקציה הדוקה יותר בין משטחים לכל אחת מיחידות המשנה, מעוטרת בידית צפיפות נוספת בצד אחד של הטבעת (Costa et al. 2011). ניתוחים מפורטים יותר הצביעו על כך שה- MCM אימץ את תצורת הטבעת המחורצת שנראתה עם ה- MCM המבודד (2-7). דגירה עם ADP · BeF3 הביא לצמצום החריץ. יתר על כן, הבולט דמוי הידית, המתאים ל- GINS/CDC45, עטוף סביב כמה יחידות משנה של MCM, כולל אלה, MCM2 ו- 5, התורמות לפער (איור 4). תצפיות אלה הובילו למסקנה כי הפעילות המשופרת של ATPase ותפקוד ההליקאז של ה- CMG ביחס למתחם MCM (2-7) הושפעו ככל הנראה מבחינה אלסטרוטית מסגירת שער MCM2 ו -5. שינוי הקונפורמציה המושרה הזה יאפשר הצבה מתאימה של משטחי ווקר A ו- Arg-finger של יחידות המשנה השונות ליצור אתר פעיל. מפתה לשער כי מתחם ה- MCM שמרים עשוי גם להניח תצורות מורכבות פתוחות וסגורות (Remus et al. 2009). יתר על כן, ייתכן כי בהיעדר GINS ושמרים CDC45 שמרים, יתכן שקיים שיווי משקל עם יותר מהמתחם בצורת סגורה מזה שנצפה עם תסיסנית מורכב.

אינטראקציה של רכיבי GINS ו- Cdc45 עם MCM. הקריקטורה מציינת את הצורה הפתוחה של MCM (2–7) עם קווים מנוקדים החושפים את האינטראקציות בין יחידות משנה של MCM לבין Psf1, 2, 3 ו- Cdc45.

יחדיו, תמונות אלה של EM מציעות מודל מפתה לאופן שבו MCM עשוי להיות מופעל במקורות שכפול (Costa et al. 2011). במקורות השכפול האוקריוטיים, מתחם MCM נטען לפני הקשר שלו עם GINS ו- CDC45. עד כה, כל הראיות הקיימות מעידות כי MCM נטען על DNA דו-גדילי במקורות (Remus et al. 2009). לפיכך, תצורת מכונת הכביסה הנעילה הפתוחה שנצפתה עבור MCM (2-7) עשויה להתאים לצורה בעלת ידע העמסה של ההליקאז. לאחר הטעינה, MCM עשוי להיזהר לצורה מישורית, אולי במקביל להמסת DNA מקומית. תבנית הגדיל המוביל תהיה בקוטביות הנכונה שתחובר ביציבות על ידי סיכות השיער β בלב הנקבוביות של ה- MCM, בעוד שתבנית הגדיל-פיגור יכולה להיעקר החוצה דרך השער. לאחר מכן, ה- DNA החד-גדילי המוחלץ יילכד על ידי ידית ה- GINS/CDC45 האגדית, שתגויס אל פני השטח החיצוניים של הליקאז הליבה (איור 5). בהקשר זה, מפתה לציין כי הוכח כי ל- MCM הארכיאלי יש משטחים המחייבים DNA על החלק החיצוני של ההליקאז (ראה איור 2). אולי אלה יכולים לשחק תפקיד בתקשור ה- DNA המוחלץ לתוספת GINS/Cdc45 על הליקאז הליבה (Rothenberg et al. 2007 Graham et al. 2011). הנתיב בפועל של גדיל ה -5 ′ ה"פיגור "בתוך או סביב המשטח החיצוני של ההליקאז נשאר אזור חשוב לחקירה.

מודל ספקולטיבי להעמסת MCM והיתוך דנ"א במקורות שכפול באאוקריה, ובהסקת מסקנות, ארכאה. שני hexamers של שער פתוח של MCM נטענים במקור. סגירת הטבעת מתרחשת, במקביל להמסה מקומית של DNA. גדיל אחד, תבנית הגדיל המוביל, נשמר בלב הליסקה השני, תבנית החוטים המוחצצים, נלכד על ידי ה- GINS/Cdc45 על המשטח החיצוני של מכלול ההליקאז.

לפיכך, למכלול ה- CMG עשויות להיות שתי נקבוביות, האחת עוברת במרכז הטורואיד של MCM שבאמצעותה מנוע ההליקאז מתקשר עם תבנית הגדילה המוליכה והשנייה בין המשטח החיצוני של MCM ו- GINS/CDC45 הלוכדות את הגדיל הפיגור. תבנית. יתכן כי כריכה נוספת זו עשויה לתרום באופן משמעותי לתהליכות ההליקאז. כמו כן, נציין כי מודל כזה יכול להסביר מדוע נצפתה כי CMG קושר מצעי DNA של מזלג באופן עדיף על מולקולות מורכבות 3′ ועם זיקה גבוהה פי 10 מה- MCM המבודד (2-7). מחקרים שלא פורסמו עם תסיסנית מתחם CMG מבסס את ההקבלות הצפויות למתחם MCM הארכיאלי. מוטציות בסיכות השיער β-presensor-1 משפיעות על הזיקה לקשירת מצע ונדרשות באופן קולקטיבי לתפקוד ההליקאז. יתר על כן, ניסויי קישור בין DNA/חלבון מגלים דפוס מובהק של MCM: אינטראקציות DNA עם גדיל 3 ′ המוביל כאשר בדיקות DNA מתוכננות עם שאריות T רגישות UV בתוך אזורי חד-גדיל של מזלג. עם זאת, לא מתגלה קישור צולב עם חלבון כאשר שאריות כאלה ממוקמות בתוך המתיחה הדופלקס הפרוקסימלית לקשר המזלג (J Pesavento, T Petojevic ו- MR Botchan, לא פורסם). תוצאות אלו מצביעות על כך שה- CMG טרנסלוקס על גדיל 3 ′ דרך מגעים הדוקים בתוך החלק הפנימי של הטורויד, ללא דופלקס בקשר אינטימי עם החלבון או כניסה לערוץ.

עבודות אחרונות באמצעות א קסנופוס מערכת נטולת תאים סיפקה הוכחה חזקה לכך שהליקאזה MCM האאוקריוטית תעבור באופן עדיף לאורך קווצת DNA אחת (Fu et al. 2011). נצפתה כי מתחם ה- CMG יכול להיעצר ביעילות רבה על ידי מחסום בצורת קישור רוחבי תוך-רחבי, קבוצת ביוטין-סטרפטבידין ספציפית לגדיל או נקודה קוונטית של 20 ננומטר המצורפת לתבנית הגדילה המובילה. לעומת זאת, לחסימות כאלו היו השפעות הרבה פחות כשהן מונחות על תבנית הגדיל. עם זאת, גושי הגדילי הפיגור עדיין גרמו לדום חולף, אם כי לרמה נמוכה יותר מכפי שנראה עם הגדיל המוביל. יתר על כן, מכיוון שהניסויים בוצעו בתמציות תאים, ניתן להעלות על הדעת כי גורמים נוספים הקיימים בתמצית מקלים על מעקף של גוש חוט בפיגור. היעדר השפעה חזקה של בלוקי התבנית עם פיגורים גדילים מצביע על כך שהמגעים שעלולים להתרחש עם הערוץ המשני או ה"משטחים החיצוניים "של טבעת ה- MCM אינם מוגבלים מבחינה סטרית והם בעלי זיקה נמוכה יותר מאשר אותם אנשי קשר שנוצרו פנימה הערוץ הראשי. הבנת האופן שבו רכיבים אחרים כגון פולימראז ה- DNA, RPA, RFC ומטען המטען מאורגנים במגע עם ה- CMG ואולי משפיעים על קצבי הפירוק יהיו אתגרים לעתיד.


צפו בסרטון: אבקת חלבון. ויקטור עזריה (יָנוּאָר 2022).