מֵידָע

האם יש ריבוזימים שחותכים גדילים כפולים


הכותרת כבר אומרת:

האם ידועים ריבוזימים החותכים גדילים כפולים? מעין ריבוזים המקביל ל- Ribonuclease III.

עם חתך, אני מתכוון לכך שעמוד השדרה של שני הגדילים, היוצרים את הגדיל הכפול, נפתח/נשבר.

תגובה: גדיל כפול אחד -> שני גדילים כפולים


בדרך כלל ידוע שלריבוזימים יש פוטנציאל להציג שבירות גדילה. עם זאת, אכן שאלה טובה האם אלה עשויים לכלול גדילים כפולים!

לרוע המזל אינני יודע את התשובה מכיוון שבדרך כלל קשה להוכיח אי-קיום, אך במאמר זה הם מרחיקים לכת לרמוז שתרגום צריך להתפתח בשל היעדר פעילות ההליקאז של ריבוזימים.

בספרות נוספת לפעילות ההליקאז (הקשורה בדרך כלל להכנסת הפסקות דו-גדיליות), נראה כי כל הריבוזימים עם פעילות ההליקאז מחוברים לחלבונים כפונקציונליים. אז אולי זה אכן אפשרי, שאין ריבוזימים שחותכים חוטים כפולים.


טיפול גנטי: עקרונות ויישומים | גנטיקה

במאמר זה נדון אודות העקרונות והיישומים של טיפול גנטי המבוסס על עיכוב ממוקד של ביטוי גנים in vivo.

עקרונות ויישומי טיפול המבוססים על עיכוב ממוקד של ביטוי גנים ב- Vivo:

אחת הדרכים לטפל בבעיות אנושיות מסוימות היא לעכב באופן סלקטיבי את ביטוי הגן שנקבע מראש in vivo. באופן עקרוני, גישה כללית זו מתאימה במיוחד לטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות, ובחלק מהפרעות אימונולוגיות.

במקרים כאלה, בסיס הטיפול הוא לדפוק את ההתרחשות והבזוינות של גן ספציפי המאפשר לתאים הסרטניים ולביישנים, זיהום, אלרגיה, דלקות וכו ', לפרוח מבלי להפריע לתפקוד תקין של התאים. לדוגמה, תשומת הלב יכולה להיות ממוקדת בעיכוב סלקטיבי של הביטוי של גן ויראלי מסוים הדרוש לשכפול ויראלי, או פעילות לא הולמת ואונקוגן מבויש וכו '.

בנוסף לאמור לעיל, עיכוב וביטוי ממוקד של ביטוי גנים עשויים להציע את האפשרות והטירוף של טיפול בבעיות מסוימות שעוברות בירושה. אם הפרעה תורשתית דומיננטית היא תוצאה של אובדן תפקוד של תפקוד, יתכן ויתאפשר טיפול באמצעות טיפול רגיל להגדלת גנים.

עם זאת, מכיוון שטרוזיגוטים עם 50% מתוצר הגן הנורמלי יכולים להיות מושפעים קשות, טיפול גנטי מוצלח בהטרוזיגוטים דורש ביטוי יעיל של הגנים שהוצגו. עם זאת, הפרעות תורשתיות דומיננטיות המתעוררות בגלל מוטציות של תפקוד תפקודי עשויות שלא להתאים להוספה פשוטה של ​​גנים רגילים.

במקום זאת, ייתכן שבמקרים מסוימים ניתן יהיה לעכב באופן ספציפי את ביטוי הגן המוטנטי, אך יש לשמור על ביטוי האלל הנורמלי. עיכוב כזה של אלל ספציפי לביטוי הגנים מתאפשר אם המוטציה הפתוגנית גורמת להבדל משמעותי ברצף בין האללים.

הביטוי של הגן הנבחר עשוי להיות מעוכב על ידי מגוון אסטרטגיות שונות. סוג אחד אפשרי של גישה כרוך ב mutagenesis spe & shycific in vivo של הגן הזה, ומשנה אותו לצורה שכבר אינה מתפקדת. מיקוד גנים על ידי רקומבינציה הומולוגית מציע את האפשרות של מוטגנזה ספציפית לאתר להשבית גן.

עם זאת, טכניקה זו הפכה לממשת לאחרונה רק עם תאים סומטיים מסוג nor & shymal דיפלואידית והיא עדיין מאוד לא יעילה וחמוקה. במקום זאת, שיטות לחסום את ההתרחשות וההתבוננות של הגן מבלי להשתנות אותו מועדפות וביישנות.

באופן עקרוני, ניתן לאפשר זאת וליצור אותו ברמות שונות: ברמת ה- DNA (על ידי חסימת שעתוק) ברמת ה- RNA (על ידי חסימת עיבוד לאחר תעתיק, הובלת mRNA או מעורבות של ה- mRNA עם הריבוזומים) או ברמת החלבון (על ידי חסימת עיבוד לאחר תרגום, ייצוא חלבונים או שלבים אחרים החשובים לתפקוד החלבון).

טיפול באמצעות עיכוב סלקטיבי של ביטוי גנים אפשרי מבחינה טכנית בכל שלוש רמות הביטוי (ראה איור 23.7):

(i) טיפולי סליל משולש (כרוך בקשירה של אוליגנוקלאוטידים ספציפיים לגן לדנ"א דו-גדילי על מנת לעכב טרנס והעתקה של גן).

(ii) טיפולים אנטי-סנסיים (כרוך בקשירה של אוליגנוקלאוטידים ספציפיים לגן או פולינוקלאוטידים ל- RNA במקרים מסוימים, סוכן המחייב עשוי להיות ריבוזיטנה ספציפית של engi & shyneered, מולקולת RNA קטליטי שיכולה לדבוק את תמלול ה- RNA).

(iii) שימוש בנוגדנים תוך-תאיים (תוך-גופים) ואפטמרים של אוליגנוקלאוטידים (כרוך בבניית נוגדנים הניתנים לכיוון למיקומים ספציפיים בתוך התאים על מנת לקשור חלבון ספציפי, או אפטומרים מסוג oligonucleotide, שיכולים להיקשר במיוחד לפוליפפטיד הנבחר. ).

טיפולי סליל משולש מסתמך על קשירה והתרחקות של אוליגנוקלאוטידים ספציפיים לגן לחריץ העיקרי של הסליל הכפול.:

Oligonucleotides קצרים סינתטיים (באורך 15-27 נוקלאוטידים) מסוגלים להתחבר באופן ספציפי לרצף של DNA דו-גדילי, ויוצרים סליל משולש. האוליגונו והשיקלוטיד נקשרים על ידי קשרי מימן של הוגסטין לדנ"א הדו-גדילי, מבלי לשבש את קישור המימן המקורי של ווטסון-קריק.

המבנים היוצבים ביותר המחוברים להוגסטין הם G הקשורים לזוג בסיס GC ו- T קשור לזוג בסיסי AT (ראה איור 23.8). למרות שמבנים כאלה יכולים לעכב שכפול DNA במבחנה, מסוקים יכולים לפרוק מבנים גדילים משולשים in vivo.

עם זאת, הוכח כי טריפלקס עבור & שיימציה חוסם את קישורם של גורמי שעתוק במבחנה, ולפחות במקרים מסוימים הושגו עדויות לעכבה ספציפית של הגן של תמלול בתאים שלמים.

Oligonucleotides הם מבנים הידרופיליים פוליאנוניים גדולים ולכן אינם מתאימים באופן אידיאלי להתפשט על פני קרום הפלזמה ההידרופויים והשיביים ביותר. משלוח ישיר לתוך הציטופלזמה באמצעות טכנולוגיות ושינויי חדירות התא מספק את הגישה היעילה ביותר לאפשר העברה לאחר מכן לגרעין, ומשלוח באמצעות ליפוזומים היא שיטה נפוצה.

לאחר מכן, האוליגנוקלאוטידים יכולים להעביר במהירות לגרעין (על ידי דיפוזיה פסיבית דרך נקבוביות המעטפת הגרעינית). בתוך התא, האוליגנוקלאוטידים חשופים להתקפת נוקלאז, בעיקר מאקסו-נוקלאזות, ומחצית החיים של אוליגנוקלאוטידים קונבנציונליים עם קשרי פוספודיאסטר היא בדרך כלל כ -20 דקות.

בהתאם לכך, נהוג לשנות את הקצוות 3 ′ ו- 5 ′ של האוליגנוקלאוטידים כדי להגן מפני התקפת נוקלאז. לעתים קרובות, שינוי כימי כולל שילוב של קשרי פוספורותיאט המכילים גופרית ליצירת מה שנקרא S-oligonucleotides.

למרות שהטכנולוגיה משתפרת במהירות, יש להתגבר על כמה קשיים כלליים. עיכוב של ביטוי גנים דורש כמויות גדולות יחסית של אוליגנוקלאוטיד. מדאיג יותר היא הגבול והשינוי שמטילים קשר מימן של הוגסטין וההתביישויות של רצפי המטרה צריכים לשאת את כל בסיסי הפורין הווירטואליים שלהם ובביישנות על קווצת DNA אחת. ניסיונות ראשוניים לפתור בעיה זו כוללים החלפה של קבוצות הפוספטים על ידי קבוצות כימיות שונות המאפשרות לאוליגנוקלאוטידים יוצרי טריפלקס לקפוץ מחוט אחד של דופלקס ה- DNA הקשור לשני.

Oligonucleotides antisense או poly & shynucleotides יכולים להיקשר ל- mRNA ספציפי, לעכב את התרגום שלו ובמקרים מסוימים להבטיח את השמדתו:

במהלך התעתיק, רק אחד משני גדילים ה- DNA בדופלקס ה- DNA, גדיל התבנית, משמש כתבנית ליצירת מולקולת RNA משלימה. כתוצאה מכך, רצף הבסיס של תמלול ה- RNA החד-גדילי זהה במהותו (פרט לכך ש- U מחליף את T) לגדיל ה- DNA השני, הנקרא באופן שימי בשם גדיל החושים.

לכן, כל אוליגונו ושקלוטידים או פולינוקלאוטידים המשתלבים ורצופים ברצף ל- mRNA, כולל גדיל התבניות של הגן, יכולים, אם כן, להיחשב כרצף אנטי-חוש.

קישור של רצף אנטי -סנס לרצף ה- mRNA המקביל צפוי להפריע לתרגום, ובכך לעכב את סינתזת הפוליפפטיד. ואכן, ידוע כי RNA אנטי -חושים המתרחש באופן טבעי מספק דרך לווסת את ביטוי הגנים בכמה תאים צמחיים ובעלי חיים, כמו גם בחלק מהחיידקים. ניתן לעצב oligonu ו shycleotides סינתטיים כך שהם משלימים ומזינים ברצף ל- mRNA ספציפי וכאשר מועברים לתאים, מראים עדויות לעיכוב הביטוי של הגן המקביל.

כתוצאה מכך, הרעיון של תרופות אנטי-סנס פותח ביטוי בלתי רצוי של גן ספציפי ברקמות המחלה יכול להיות מעוכב באופן סלקטיבי באמצעות רצף אנטי-סנס ספציפי של artificia & shylly. ניתן להשתמש במגוון סוגים שונים של רצף אנטי -סנס.

Oligodeoxynucleotides Antisense:

לעתים קרובות מועדף השימוש באוליגונו ובשיקלוטידים מלאכותיים נגד החושים, פשוט מכיוון שניתן לסנתז אותם בצורה כה פשוטה. ניתן להעביר אותם ביעילות לתוך הציטופלזמה של תאים באמצעות ליפוזומים, ויציבותם התוך תאית משתפרת על ידי שימוש באוליגנוקלאוטידים מודימיים ומעוטרים, בעיקר S-oligonucleo & shytides (ראו הערה לעיל שלמרות שאוליגנוקלאוטידים אנטיסנסים נודדים לגרעין, הם אינם מחברים את הדו-גדילי. DNA מכיוון שהם אינם מיועדים להשתתף בהצמדה של מימן מסוג Hoogsteem).

Oligodeoxynucleotides (ODN) עדיפים על פני oligoribonucleotides מכיוון שהם פגיעים באופן כללי וביישוש פחות להתקפת נוקלאז, וחשוב מכך שיש להם את היתרון הנוסף של גרימת הרס mRNA שאליו הם נקשרים.

הסיבה לכך היא כי היברידית ODN-mRNA, כמו כל הכלאות DNA-RNA, חשופה להתקפה ולמחשוף סלקטיבי של גדיל ה- RNA על ידי סוג מסוים של ריבונוקלאז תוך-תאי, RNase H. למרות בעיות בקיעת שיניים במחקרים מוקדמים, עידון הטכנולוגיה פירוש הדבר כי כיום ODNs כבעלי פוטנציאל טיפולי רב נחשבים כבעלי ODN נגד חשיבה, ומחקרים קליניים מתנהלים כעת במספר מחלות אנושיות

גנים אנטיסנס:

Oligonucleotides antisense, גם אם הם משתנים כימית, אינם יציבים ללא הגבלה ובביישנות. אחת הדרכים להבטיח אספקה ​​רציפה של רצף אנטי -חושים היא צורה של שיבוט ביטוי בו מועבר גן אנטי -סנס שתוכנן במיוחד לתאים הרלוונטיים. ניתן להנדס גן כזה פשוט על ידי בניית מיני-גן שבו רצף קידוד הפוך מוצב במורד הזרם של מקדם עוצמתי.

גדיל ה- DNA המשמש בדרך כלל כחוט החושים מתעתק כעת ונותן RNA אנטי -סנס אשר ניתן לסנתז שוב ושוב (איור 23.9). אם הגן antisense מסופק באמצעות וקטור אינטגרטיבי, ניתן להשיג ייצור ארוך טווח של RNA אנטי-חוש.

ריבוזיםש:

יותר ויותר מתברר שמולקולות ה- RNA שונות מבחינה תפקודית ממולקולות ה- DNA באופן קולקטיבי, הן יכולות לשרת פונקציות מגוונות, במקום להיות מעורבות בהעברת מידע וגנטי. חלק ממולקולות ה- RNA מסוגלות להוריד את אנרגיית ההפעלה לתגובות ביוכימיות ספציפיות, ולתפקד בצורה כה יעילה כאנזימים (ריבוזימים). לדוגמה, הטראן וטקסטים של אינטרונים של קבוצה 1 הם אוטוקטליים וחולקים את עצמם.

ריבוזימים אחרים המפרקים RNA הם פעילים-טרנס, כלומר הם מבקעים רצף RNA על מולקולה אחרת. הם מכילים שני רצפי זיהוי מטרה חיוניים ומביישים (המתבססים יחד עם רצפים משלימים על מולקולות RNA מטרה), וכן קומו קטליפטית, בדומה לאתר הפעיל של אנזים (החוצץ את מולקולת ה- RNA היעד בזמן שזיווג הבסיס מחזיק אותו מקום).

המחשוף מוביל לחוסר הפעלה של ה- RNA, ככל הנראה בגלל הכרה לאחר מכן על ידי גרעינים תאיים של שני הקצוות הלא טבעיים. דוגמאות כוללות ריבונוקלאז אנושי P וריבוזימים שונים המתקבלים מווירואידים צמחיים (חלקים דמויי וירוסים).

ניתן להשתמש בהנדסה גנטית לעיצוב מותאם אישית של רצף ההכרה כך שיכיל רצפים אנטי-חושים שיכולים להתאים זוג למולקולת mRNA ספציפית, תוך שמירה על האתר הקטליטי (ראה איור 23.10). לאחר מכן ניתן להעביר גנים מהונדסים שניתן לתמלל אותם כדי לייצר את הריבוזים הרצוי לתאים מתאימים.

אפליקציה אחת ויחידה הייתה עיצוב ריבוזימים נגד אונקופרוטאינים ספציפיים. מחקרי פיילוט הראו כי העברה של גן ריבוזים אנטי-ראס לתאי קרצינו ושיימה שלפוחית ​​השתן עם המוטציה ras הביאה לחסימת ייצור ה- Ras והיפוך התכונות הגרורתיות, הפולשניות והגידוליות של התאים. בעיות מוקדמות ביעילות המיקוד למטרות שלהן בתוך התא מטופלות כעת וכבר נפתחו ניסויים קליניים במקרים מסוימים, כגון בטיפול גנטי לאיידס.

אנטיביו ותאי תוך תאיים מעוצבים באופן מלאכותי (תוך גופים), אוליגנוקלאוטידים (אפטאמים) וחלבונים מוטנטים יכולים לעכב את תפקודו של פוליפפטיד ספציפי:

נוגדנים תוך תאיים (תוך גופים):

תפקוד הנוגדנים מתנהל בדרך כלל חוץ-תאי: לאחר סינתזה, נוגדנים מופרשים בדרך כלל לנוזל החוץ-תאי או נשארים ממברנה קשורה על פני התא B כקולטני אנטיגן. אולם לאחרונה הורחבה הנדסת anti & shybody לעיצוב גנים המקודדים נוגדנים ותאיים תאיים ותאיים.

הישג זה מעלה את האפשרות להשתמש בנוגדנים בתוך התאים כדי לחסום בניית וירוסים או חלבונים מזיקים, כגון אונקופרוטאינים. הבחינה הראשונה והשיטה של ​​גישה זו כללה הנדסת הנוגדן F105 אשר נקשר ל- gp120, נגיף חיסוני חיסוני אנושי (HIV) עוטף שחלבון העוטף את נגיף האיידס להדבקת תאי המטרה שלו.

חלבון מעטפת זה נגזר מקודם גדול יותר gp160 אשר מסונתז ברטיקולום האנדופלזמי. מארסקו ושיתופי פעולה וקונים עיצבו גן חדש מסוג F105 אשר מקודד ומבייש נוגדן שבא לידי ביטוי ביציבות ונשמר ברטיקולום האנדופלזמי מבלי להיות רעיל לתאים. ה- anti & shybody המהונדס נקשר לחלבון מעטפת ה- HIV בתוך התא ומעכב עיבוד של מבשר ה- gpl60, ובכך מפחית באופן משמעותי את ההדבקות של חלקיקי ה- HIV-1 המיוצרים על ידי התא.

Oligonucleotide Aptamers:

ניתן לסנתז oligonucleotides מנווונים לחלוטין על ידי מתן 25% כל אחד מארבעת הבסיסים A, C, G ו- T בכל מיקום בסיס במהלך סינתזה של אוליגנוקלאוטיד. כתוצאה מכך, מספר התמורות ברצף שניתן ליצור (4 ″ כאשר n הוא האורך הנבחר של האוליגנוקלאוטיד) יכול להיות עצום.

ניתן להשתמש בתערובת התוצאה והביישנות של oligonucleotides כדי לבדוק את היכולת להיקשר לחלבון מטרה שנבחר (מיקוד אפיטופ חלבון). ב- prac & shytice, השימוש באוליגונו ובשיקלוטידים מנווונים חלקית עדיף כך שריכוז האוליגנוקלאוטידים בודדים לא יהיה נמוך מדי.

למעשה, המשמעות היא סינון בו זמנית של אלפים רבים של אוליגנוקלאוטידים, ולכן הסיכוי שלפחות אפיטופ אחד של מטרת הפרו & שייטן להיות קשור במיוחד באוליגונו ושקלוטידים יכול להיות גבוה. ניתן לחלץ מהחלבון את האוליגנוקלאוטיד הכבול (המכונה לפעמים אדפטמר או אפטמר) ולזהות את רצף ההכרה הספציפי. העברת כמויות גדולות של אפטאמר שיוצב על ידי che ובתאים לתאים יכולה לגרום לקשר ספציפי לפוליפפ ושטיד שנקבע מראש, ובכך לחסום את תפקודו.

הצלחה ראשונית הייתה זיהוי oligonucleotides שיכולים להיקשר ולדכא את הטרומבין פרוטאז, שהוא חלק ממפל קרישת הדם. תפקודי טרומבין בסרום וביישומים תאיים מסוג זה אינם שונים באופן עקרוני מטיפול תרופתי סטנדרטי. עם זאת, השימוש העתידי באפטמרים של oligonucleotide לעיכוב מטרות תאיים ופרו -תאניות ספציפיות יכלול בהכרח שינוי גנטי של תאים, ולכן יכול להיחשב כסוג של טיפול גנטי.

חלבונים מוטנטים:

מטבעות ושיטות תפקוד תפקודיים המתרחשים באופן טבעי יכולים להיות כרוכים בייצור של פוליפפטיד מוטנטי הנקשר ל- pro & shytein מסוג פראי, ומעכב את תפקודו. במקרים רבים כאלה, הפוליפפטידים מסוג הבר מתקשרים באופן טבעי ליצירת מולטימרים, ושילוב וחלבון של חלבון מוטנטי מעכב תהליך זה.

במקרים מסוימים, טיפול גנטי עשוי להיות אפשרי על ידי תכנון גנים לקודד חלבון מוטנטי שיכול להיקשר באופן ספציפי לחלבון שנקבע מראש, כגון חלבון החיוני למחזור החיים של הפתוגן. לדוגמה, צורה אחת של טיפול גנטי באיידס כוללת ייצור מלאכותי של חלבון HIV-1 מוטציה בניסיון לעכב ריבוי של חלבוני הליבה הנגיפיים.

תיקון מלאכותי של מוטציה פתוגנית in vivo אפשרי, באופן עקרוני, אך הוא מאוד לא יעיל ואינו קריא ומתבייש ביישומים קליניים:

הפרעות מסוימות הן מטרות לא קלות לטיפול גנטי. לדוגמה, אי אפשר לטפל בהפרעות דמויות ועצומות שבהן מוטציה פשוטה מביאה לרווח תפקודי פתוגני על ידי טיפול להגדלת גנים, וייתכן שיהיה קשה להשיג עיכוב ממוקד של ביטוי גנים. עיכוב היעד מתאים ביותר לעכב ביטוי גנים חדשני או בלתי הולם בתאים אנושיים, למשל ביטוי של גנים ויראליים, אונקוגנים וכו '. ייתכן שיהיה צורך לעכב ביטוי של אלל מוטנטי בעל רווח תפקודי תוך שמירה על ביטוי של חיות בר דומות מאוד -קלד אלל.

אם האלל המוטנטי נושא שינוי משמעותי ברצף באתר המוטציה, ייתכן שיהיה אפשר להשיג עיכוב סלקטיבי אך אם השינוי הוא מוטציה פשוטה, נניח החלפת נוקלאוטיד אחת, ייתכן שיהיה צורך בגישות אחרות. אחת הגישות האפשריות היא תיקון מוטציה מבוירת ומבוטלת על ידי הכנסת כמה ריאגנטים לתאים על מנת לשנות את רצף המוטנטים בחזרה לצורה התואמת את התפקוד הרגיל.

באופן עקרוני, ישנן מספר דרכים שונות שבהן ניתן לאתר מוטציה מסוימת באופן סלקטיבי in vivo, בעיקר ברמת ה- DNA. אחת הדרכים היא להשתמש בטכנולוגיה ובשיניקה של מיקוד גנים המבוססים על רקומבינציה הומולוגית.מכיוון שגישה זו מציעה את היכולת לבצע שינויים ספציפיים לאתר של גנים אנדוגיים וביישנים, היא מייצגת שיטה בעלת פוטנציאל כוח וביישנות לטיפול גנטי: ניתן לתקן מוטציות שנרכשות וגם תורשתיות, וניתן לשנות מהונדסים שינויים חדשים בגנום.

עד כה, טכניקה זו הוגבלה בעיקר לעובר עכברים רב -תכליתי ותאי גזע ביישניים, אם כי לאחרונה היא הוחלה על תאים סומטיים דיפלואידים רגילים. עם זאת, חוסר היעילות והביישנות של הליך זה (גם בעת שימוש במטרה האידיאלית של תאים בתרבית במבחנה) ו הצורך לתקן את הפגם בתאים רבים ושונים in vivo גרם לכך שיישומים קליניים רחוקים.

גישה חלופית היא תיקון הפגם הגנטי ברמת ה- RNA. אפשרות אחת וביישנות היא להשתמש בריבוזים טיפולי. שיטה אחת צופה שימוש במעמד של ריבוזימים המכונים אינטרונים של קבוצה I, המובחנים ומעוותים על ידי יכולתם להתקפל לצורה מאוד ספציפית, המסוגלת לחתוך ולהרתיע ולהרתיע RNA.

אם לתמליל יש, למשל, שטות או מוטציה של misense, יתכן שיהיה אפשר לעצב ריבוזימים ספציפיים שיכולים לחתוך את ה- RNA במעלה הזרם של המוטה והשיטון ולאחר מכן לחבור בתמליל מתוקן, צורה של שחבור-טרנס (ראו איור 2 א). 23.11). עד כה, טכנולוגיה זו נמצאת בחיתוליה, ויש לשפר את היעילות של החתול והשייליטי. אפשרות נוספת היא עריכת RNA וביישנות טיפוליות.

זה כולל שימוש באוליגנוקלאוטיד RNA משלים כדי להיקשר במיוחד לתמליל מוטנטי ברצף המכיל את המוטציה הנקודתית הפתוגנית, ואנזים לעריכת RNA, כגון אדנאזין RNA דו-גדילי, כדי לכוון את שינוי הבסיס הרצוי. שוב הטכנולוגיה הזו נמצאת בחיתוליה וצריך להתגבר על קשיים טכניים אדירים לפני שניתן יהיה לראות יישומים קליניים.


ביולוגיה מולקולרית

הפוספט הקרוב ביותר לסוכר הוא האלפא פוספט והפוספט הבא (האמצעי) הוא ביתא הפוספט והפוספט הרחוק ביותר מהסוכר הוא הגאמה פוספט.

ישנם 4 בסיסים חנקניים, אדנין וגואנין (פורין) שיש להם 2 טבעות. לציטוזין ותימין (פירמידינים) טבעת אחת. בסיסים אלה מתחברים לסוכר הדאוקסיריבוז באמצעות קשר B-N-glycosidic.

Purines זוג עם פירמידות.
לאדנין ולתימין יש 2 קשרי H, לגואנין ולציטוזין 3 קשרים. (תכולת GC היא 40.3% בבני אדם)

גנים רבים אינם רציפים, והם מתחלקים
Þ אקסונים - מכילים מידע לקוד של חלבון
Þ Introns - מכילים מידע שאינו נחוץ לקידוד חלבון

מיקום - רקמות/תא ספציפיות - לאילו רקמות/תאים מיועדים

● במשפחה מרובת גנים פשוטה כל הגנים זהים
○ מתרחשת כאשר המוצר הגן נחוץ בכמויות גדולות
○ למשל גני ה- RNA הריבוזומליים קיימים במשפחה מרובת גנים פשוטה ויש צורך בהרבה RNA ריבוזומלי לריבוזומים

● במשפחות מורכבות מרובות הגנים הגנים אינם זהים אך יש להם רצפי DNA דומים, ולכן הם מקודדים לחלבונים דומים
○ גני הגלובין האנושיים הם דוגמה לכך
■ 2 חלבוני אלפא ו -2 בטא גלובין משלבים יצירת המוגלובין
■ גני הגלובין האנושיים יוצרים 2 משפחות מולטיגניות מורכבות, גני האלפא-גלובין = כרומוזום 16
גנים בטא-גלובין = כרומוזום 11
■ הם באים לידי ביטוי בשלבים שונים בהתפתחות האדם: הגן העוברי יוצר המוגלובין בעל זיקה גבוהה יותר לחמצן כך שניתן להעביר את החמצן מהאם לילד.

שמרני:
גדילי הורים מקוריים נשארים יחד ומייצרים עותק, ויוצרים גדיל בת מזווג

חצי שמרני:
כל גדיל משמש כתבנית עבור גדיל חדש.
נוקלאוטידים צפים חופשיים יוצרים קשרי פוספודיאסטר עם בסיסים חינם על התבניות ופורין נקשר עם פירימידין. פולימראז DNA מזרז יצירת קשרי פוספודיאסטר בין נוקלאוטידים לצורות עמוד השדרה של פוספט סוכר. כל מולקולה חדשה מכילה גדיל אחד ישן ואחד חדש.

מפזר:
אופן היפותטי של שכפול DNA בו שני הפולינוקלאוטידים של כל סליל כפול מורכבים בחלקם מדנ"א הורי ובחלקו מדנ"א שסונתז לאחרונה.

טופואיזומראסים של DNA הם אנזימים המפרידים בין שני הגדילים במולקולת DNA מבלי לסובב בפועל את הסליל הכפול. הם משיגים הישג זה על ידי גרימת שברים חולפים בעמוד השדרה של הפולינוקלאוטיד.

2) פולימראזות DNA פועלות בכיוון 5 'עד 3'.
הגדיל המוביל משתמש בשכפול רציף מכיוון שהוא קיים בכיוון 5 'עד 3'.
העתקת גדילים בפיגור בכיוון 3 עד 5 כך שתשתמש בשכפול בלתי רציף (שברי אוקזאקי)

3) תחילת DNA: בחיידקים הפריימר נוצר על ידי אנזים פרימאז (שני אנזימי פרימזה יוצרים פרימוזום),
באיקריוטים, הפריימר מורחב על ידי DNA פולימראז אלפא
הפריימר בכל שכפול ה- DNA עשוי RNA.

4) שכפול DNA חיידקי
אנזים פרימאז [פולימראז RNA] מייצר את הפריימר
DNA polymerase III = אנזים משכפל עיקרי

שכפול DNA אוקריוטי
DNA פולימראז אלפא = יוזם סינתזה של DNA על ידי הארכת פריימר
דלתא פולימראז DNA = האנזים המשכפל העיקרי של הסינתזה


תוכן

המונח אנזים הגבלה מקורו במחקרים של phage λ, וירוס המדביק חיידקים, ותופעת ההגבלה והשינוי המבוקר על ידי המארח של פאגים או חיידקים כאלה. [11] התופעה זוהתה לראשונה בעבודות שנעשו במעבדות סלבדור לוריא, ווייגל וג'וזפה ברטני בתחילת שנות החמישים. [12] [13] נמצא כי עבור בקטריופאג λ שיכול לצמוח היטב בזן אחד של אי קולי, לדוגמה אי - קולי C, כאשר הוא גדל בזן אחר, למשל אי - קולי K, התשואות שלה יכולות לרדת באופן משמעותי, עד 3-5 סדרי גודל. התא המארח, בדוגמה זו אי - קולי K, ידוע כמארח המגביל ונראה כי יש לו את היכולת להפחית את הפעילות הביולוגית של הפאג λ. אם הפאג מתבסס בזן אחד, יכולתו של אותו הפאג לצמוח להיות מוגבלת גם בזנים אחרים. בשנות השישים הוכח בעבודות שנעשו במעבדותיהם של ורנר ארבר ומתיו מסלסון שההגבלה נגרמת על ידי מחשוף אנזימטי של ה- DNA הפאגי, ולכן האנזים המעורב נקרא אנזים הגבלה. [4] [14] [15] [16]

אנזימי ההגבלה שנחקרו על ידי ארבר ומסלסון היו אנזימי הגבלה מסוג I, המפרקים את ה- DNA באופן אקראי מאתר הזיהוי. [17] בשנת 1970, המילטון או סמית ', תומאס קלי וקנט וילקוקס בודדו ואפיינו את אנזים ההגבלה הראשון מסוג II, אֲחוֹרִיII, מהחיידק Haemophilus influenzae. [19] [20] מאוחר יותר, דניאל נת'נס וקתלין דאנה הראו כי מחשוף של דנ"א וירוס 40 (SV40) על ידי אנזימי הגבלה מניב שברים ספציפיים אותם ניתן להפריד באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד, ובכך מראה כי ניתן להשתמש באנזימי הגבלה גם למיפוי DNA. [21] על עבודתם בגילוי ואפיון אנזימי הגבלה, הוענק פרס נובל לפיזיולוגיה או לרפואה לשנת 1978 לוורנר ארבר, דניאל נטנס והמילטון או סמית. [22] גילוי אנזימי ההגבלה מאפשר מניפולציה של ה- DNA, מה שמוביל לפיתוח טכנולוגיית DNA רקומביננטי שיש לה יישומים רבים, למשל, המאפשר ייצור חלבונים בהיקף גדול כמו אינסולין אנושי המשמש חולי סוכרת. [12] [23]

סביר להניח שאנזימי הגבלה התפתחו מאב קדמון משותף והתפשטו באמצעות העברת גנים אופקית. [24] [25] בנוסף, ישנן עדויות גוברות לכך שאנדו -נוקלאזות הגבלה התפתחו כאלמנט גנטי אנוכי. [26]

אנזימי הגבלה מזהים רצף ספציפי של נוקלאוטידים [2] ומייצרים חתך דו-גדילי ב- DNA. ניתן לסווג את רצפי ההכרה גם במספר הבסיסים באתר הזיהוי שלו, בדרך כלל בין 4 ל -8 בסיסים, ומספר הבסיסים ברצף יקבע את התדירות שבה האתר יופיע במקרה בכל גנום נתון, למשל, a רצף זוגות של 4 בסיס יתרחש באופן תיאורטי אחת ל -4^4 או 256bp, 6 בסיסים, 4^6 או 4,096bp ו- 8 בסיסים יהיו 4^8 או 65,536bp. [27] רבים מהם הם פלינדרומיים, כלומר רצף הבסיס קורא את אותם קדימה ואחורה. [28] בתיאוריה, ישנם שני סוגים של רצפים פלינדרומיים שיכולים להיות אפשריים ב- DNA. ה דמוי מראה הפלינדרום דומה לאלה המצויים בטקסט רגיל, שבו רצף קורא את אותו קדימה ואחורה על קווצת DNA אחת, כמו ב- GTAATG. ה חזרה הפוכה הפלינדרום הוא גם רצף שקורא את אותם קדימה ואחורה, אך הרצפים קדימה ואחורה נמצאים בחוטי DNA משלימים (כלומר של DNA דו-גדילי), כמו ב- GTATAC (GTATAC משלים ל- CATATG). [29] פאלינדרומים חוזרים הפוכים נפוצים יותר ובעלי חשיבות ביולוגית גדולה יותר מאשר פאלינדרום דמוי מראה.

ואילו מחשוף אנזי הגבלת SmaI מייצר קצוות "בוטים":

רצפי ההכרה ב- DNA שונים עבור כל אנזים הגבלה, ומייצרים הבדלים באורך, ברצף ובכיוון המיתר (5 'סוף או 3' סוף) של "סף" דביק של הגבלת אנזים. [30]

אנזימי הגבלה שונים שמזהים את אותו רצף ידועים בשם neoschizomers. לעתים קרובות אלה מתחלקים במקומות שונים של הרצף. אנזימים שונים המזהים ונדבקים באותו מיקום ידועים בשם isoschizomers.

אנדו -נוקליזות מגבלות טבעיות מסווגות לארבע קבוצות (סוגים I, II III ו- IV) בהתבסס על ההרכב שלהן ודרישות קופקטור האנזים, אופי רצף היעד שלהן ומיקום אתר מחשוף ה- DNA שלהם ביחס לרצף המטרה. [31] [32] [33] ניתוחי רצף DNA של אנזימי הגבלה מראים עם זאת וריאציות גדולות, המצביעות על כך שיש יותר מארבעה סוגים. [34] כל סוגי האנזימים מזהים רצפי DNA קצרים ספציפיים ומבצעים את המחשוף האנדונוקלאוליטי של ה- DNA בכדי לתת שברים ספציפיים עם 5'-פוספטים סופניים. הם נבדלים ברצף הזיהוי שלהם, בהרכב יחידת המשנה, במיקום המחשוף ובדרישות הקופקטור, [35] [36] כפי שתסוכם להלן:

  • אנזימים מסוג I (EC3.1.21.3) נפרצים באתרים מרוחקים מאתר זיהוי דורשים ATP ו- S-adenosyl-L-methionine לתפקד חלבון רב תכליתי הן עם עיכול הגבלה והן עם פעילויות מתילאז (EC2.1.1.72).
  • אנזימים מסוג II (EC3.1.21.4) נפרדים בתוך או במרחקים ספציפיים קצרים מאתר זיהוי הדורשים לרוב תפקוד יחיד של מגנזיום (עיכול הגבלה) שאינם תלויים במתילאז.
  • אנזימים מסוג III (EC3.1.21.5) נפרדים באתרים במרחק קצר מאתר זיהוי דורשים ATP (אך לא מתרבים אותו) S-adenosyl-L-methionine מעורר את התגובה אך אינו נדרש להתקיים כחלק ממכלול עם מתילאז שינוי (EC2.1.1.72).
  • אנזימים מסוג IV מכוונים ל- DNA שונה, למשל מתילציה, הידרוקסימתילציה ו- DNA של גלוקוזיל הידרוקסימתילציה
  • אנזימים מסוג V משתמשים ב- RNAs מדריכים (gRNAs)

הקלד l ערוך

אנזימי הגבלה מסוג I היו הראשונים שזוהו וזוהו לראשונה בשני זנים שונים (K-12 ו- B) של אי - קולי. [37] אנזימים אלה נחתכים באתר השונה, והוא נמצא במרחק אקראי (לפחות 1000 bp), מאתר הזיהוי שלהם. מחשוף באתרים אקראיים אלה עוקב אחר תהליך של טרנסלוקציה של DNA, המראה כי אנזימים אלה הם גם מנועים מולקולריים. אתר הזיהוי הוא א-סימטרי והוא מורכב משני חלקים ספציפיים-אחד המכיל 3-4 נוקלאוטידים, ואחד אחר המכיל 4-5 נוקלאוטידים-המופרדים על ידי מרווח לא ספציפי של כ- 6-8 נוקלאוטידים. אנזימים אלה הם רב תכליתיים והם מסוגלים הן להגביל את העיכול והן את פעולות השינוי, בהתאם למצב המתילציה של ה- DNA היעד. הקופקטורים S-Adenosyl methionine (AdoMet), יוני-אדנוזין טריפוספט (ATP) ומיוני מגנזיום (Mg 2+) נדרשים לפעילותם המלאה. לאנזימי הגבלה מסוג I יש שלוש יחידות משנה הנקראות HsdR, HsdM ו- HsdS HsdR נדרש לעיכול הגבלה HsdM נחוץ להוספת קבוצות מתיל לאירוח ה- DNA (פעילות מתילטרנספרז), ו- HsdS חשוב לספציפיות של אתר ההכרה (מחייב DNA) בנוסף הן לעיכול הגבלה (מחשוף DNA) והן לשינוי (DNA מתילטרנספרז). [31] [37]

סוג II עריכה

אנזימי הגבלה טיפוסיים מסוג II שונים מאנזימי הגבלה מסוג I בכמה אופנים. הם יוצרים הומודימרים, עם אתרי זיהוי שלרוב אינם מחולקים ופלינדרומיים ואורכם 4-8 נוקלאוטידים. הם מזהים ודוחקים DNA באותו אתר, והם אינם משתמשים ב- ATP או ב- AdoMet לפעילותם - הם בדרך כלל דורשים Mg 2+ בלבד כקופקטור. [28] אנזימים אלה מבקעים את הקשר הפוספודיאסטר של ה- DNA הסליל הכפול. הוא יכול להיבקע במרכז שני הגדילים כדי להניף קצה בוטה, או בעמדה משובשת ולהשאיר תלייות שנקראות קצוות דביקים. [39] אלה הם אנזימי ההגבלה הנפוצים ביותר והשימושיים. בשנות התשעים ותחילת שנות האלפיים התגלו אנזימים חדשים ממשפחה זו שלא עמדו בכל הקריטריונים הקלאסיים של סוג האנזים הזה, ונומנקטוריית תת -משפחה חדשה פותחה כדי לחלק את המשפחה הגדולה הזו לקטגוריות משנה המבוססות על סטיות ממאפיינים אופייניים של אנזימים מסוג II. . [28] קבוצות משנה אלה מוגדרות באמצעות סיומת אותיות.

אנזימי הגבלה מסוג IIB (למשל BcgI ו- BplI) הם מרובי תאים, המכילים יותר מיחידת משנה אחת. [28] הם מבקשים DNA משני צידי ההכרה שלהם כדי לחתוך את אתר הזיהוי. הם דורשים קופקטורים של AdoMet ו- Mg 2+. אנדו -נוקליזות מסוג IIE (למשל NaeI) מבקעות DNA לאחר אינטראקציה עם שני עותקים של רצף הזיהוי שלהם. [28] אתר זיהוי אחד משמש כמטרה למחשוף, ואילו השני פועל כאפקטור אלוסטרי המאיץ או משפר את יעילות המחשוף של האנזים. בדומה לאנזימים מסוג IIE, אנדו -נוקליזות מסוג IIF (למשל NgoMIV) מתקיימות באינטראקציה עם שני עותקים של רצף הזיהוי שלהן אך מבקשות את שני הרצפים בו זמנית. ] [28] אנדו -נוקליזות מסוג IIM, כגון DpnI, מסוגלות לזהות ולחתוך DNA מתילט. [28] [40] [41] אנדו -נוקליזות מסוג IIS (למשל, פוקא) בוחרים DNA במרחק מוגדר מאתרי הזיהוי האסימטריים הלא-סימטריים הפלינדרומיים שלהם [28] מאפיין זה נמצא בשימוש נרחב לביצוע שיטות שיבוט במבחנה כגון שיבוט שער הזהב. אנזימים אלה עשויים לתפקד כדימרים. באופן דומה, אנזימי הגבלה מסוג IIT (למשל Bpu10I ו- BslI) מורכבים משתי יחידות משנה שונות. חלקם מזהים רצפים פלינדרומיים ואילו לאחרים יש אתרי זיהוי אסימטריים. [28]

סוג III עריכה

אנזימי הגבלה מסוג III (למשל, EcoP15) מזהים שני רצפים נפרדים שאינם פלינדרומיים המכוונים הפוך. הם חתכו DNA בערך 20-30 זוגות בסיס לאחר אתר הזיהוי. [42] אנזימים אלה מכילים יותר מיחידת משנה אחת ודורשים קופקטורים של AdoMet ו- ATP לתפקידם במתילציה של DNA ובעיכול הגבלה, בהתאמה. [43] הם מרכיבים של מנגנוני שינוי הגבלת DNA פרוקריוטיים המגנים על האורגניזם מפני פולש ל- DNA זר. אנזימים מסוג III הם חלבונים הטרו-אוליגומרים, רב תכליתיים המורכבים משתי יחידות משנה, Res (P08764) ו- Mod (P08763). יחידת המשנה של Mod מזהה את רצף ה- DNA הספציפי למערכת והיא מהווה מתיל -טרנספרז שינוי ככזה, היא שקולה מבחינה תפקודית ליחידות המשנה M ו- S של אנדו -נוקליזת הגבלה מסוג I. יש צורך במילוי לעיכול הגבלה, אם כי אין לו פעילות אנזימטית בכוחות עצמו. אנזימים מסוג III מזהים רצפי DNA אסימטריים קצרים באורך 5-6 bp וחותכים 25-27 bp במורד הזרם כדי להשאיר בליטות 5 'חד-גדיליות קצרות. הם דורשים נוכחות של שני אתרי זיהוי לא מתיליים הפוכים הפוכים על מנת להתרחש עיכול הגבלה. אנזימים אלה מתילטים רק גדיל אחד של ה- DNA, במיקום N-6 של שאריות אדנוזיל, ולכן ל- DNA המשוכפל החדש יהיה רק ​​גדיל אחד מתילט, וזה מספיק כדי להגן מפני עיכול הגבלה. אנזימים מסוג III שייכים למשפחת הבטא של N6 אדנין מתיל טרנספרזים, המכילים את תשעת המוטיבים המאפיינים משפחה זו, כולל מוטיב I, כיס AdoMet מחייב (FXGXG) ומוטיב IV, האזור הקטליטי (S/D/N (PP ) Y/F). [35] [44]

סוג IV עריכה

אנזימים מסוג IV מזהים DNA שונה, בדרך כלל מתילט, ומוצגים על ידי מערכות McrBC ו- Mrr אי - קולי. [34]

סוג V ערוך

אנזימי הגבלה מסוג V (למשל, קומפלקס cas9-gRNA מ- CRISPRs [45]) משתמשים ב- RNAs מדריכים כדי למקד לרצפים ספציפיים שאינם פלינדרומיים הנמצאים באורגניזמים פולשים. הם יכולים לחתוך DNA באורך משתנה, בתנאי שמסופק RNA מדריך מתאים. הגמישות וקלות השימוש באנזימים אלה הופכים אותם למבטיחים ליישומים עתידיים של הנדסה גנטית. [45] [46]

אנזימי הגבלה מלאכותית ערוך

ניתן לייצר אנזימי הגבלה מלאכותיים על ידי מיזוג תחום מחייב DNA או מהונדס טבעי לתחום נוקלאז (לרוב תחום המחשוף של אנזים ההגבלה מסוג IIS פוקאני). [47] אנזימי הגבלה מלאכותיים מסוג זה יכולים למקד לאתרי DNA גדולים (עד 36 bp) וניתן להנדס אותם בכדי להיקשר לרצפי DNA רצויים. [48] ​​גרעיני אצבעות אבץ הם אנזימי ההגבלה המלאכותית הנפוצים ביותר והם משמשים בדרך כלל ביישומי הנדסה גנטית, [49] [50] [51] [52] אך יכולים לשמש גם ליישומים סטנדרטיים יותר של שיבוט גנים. [53] אנזימי הגבלה מלאכותיים אחרים מבוססים על התחום המחייב DNA של אפקטורי TAL. [54] [55]

בשנת 2013, טכנולוגיה חדשה CRISPR-Cas9, המבוססת על מערכת הגנה ויראלית פרוקריוטית, תוכננה לעריכת הגנום, והיא אומצה במהירות במעבדות. [56] לפרטים נוספים קרא את CRISPR (מקובצים חוזרות קצרות בין -פאלינדרומיות).

בשנת 2017 דיווחה קבוצה מאוניברסיטת אילינוי על שימוש בחלבון ארגונאוט שנלקח ממנה Pyrococcus furiosus (PfAgo) יחד עם מדריך ה- DNA לעריכת ה- DNA בַּמַבחֵנָה כאנזימי הגבלה מלאכותיים. [57]

פותחו גם ריבונוקלאזים מלאכותיים הפועלים כאנזימי הגבלה ל- RNA.מערכת מבוססת PNA, הנקראת PNAzyme, כוללת קבוצת Cu (II) -2,9-dimethylphenanthroline המחקה ריבונוקלאזות לרצף RNA ספציפי ונדבקת באזור לא מזווג (RNA בליטה) של ה- RNA הממוקד שנוצר כאשר האנזים קושר את ה- RNA. אנזים זה מציג סלקטיביות על ידי ביקוע רק באתר אחד שאין לו התאמה או שהוא מועדף מבחינה קינטית מתוך שני אתרי מחשוף אפשריים. [58]

גזירת שם EcoRI
נוֹטָרִיקוֹן מַשְׁמָעוּת תיאור
ה Escherichia סוּג
שיתוף coli מינים ספציפיים
ר RY13 מתח
אני זוהה לראשונה סדר זיהוי
בחיידק

מאז גילוים בשנות ה -70, זוהו אנזימי הגבלה רבים למשל, אפינו יותר מ 3500 אנזימי הגבלה מסוג II. [59] כל אנזים נקרא על שם החיידק שממנו הוא מבודד, באמצעות מערכת שמות המבוססת על סוג חיידקים, מינים וזנים. [60] [61] לדוגמה, שמו של האנזים הגבלת EcoRI נגזר כפי שמוצג בתיבה.

אנזימי הגבלה מבודדים משמשים למניפולציה של DNA ליישומים מדעיים שונים.

הם משמשים כדי לסייע בהכנסת גנים לקטורי פלסמיד במהלך שיבוט גנים וניסויים בייצור חלבון. לשימוש מיטבי, פלסמידים המשמשים בדרך כלל לשבוט גנים משתנים כך שיכללו קצר פולינקר רצף (הנקרא אתר השיבוט המרובה, או MCS) העשיר ברצפי זיהוי אנזים הגבלה. זה מאפשר גמישות כאשר החדרת שברי גנים לאתרי הגבלת וקטור הפלסמיד הכלולים באופן טבעי בתוך הגנים משפיעים על בחירת האנדו -נוקליז לעיכול ה- DNA, שכן יש צורך להימנע מהגבלה של ה- DNA המבוקש תוך חיתוך מכוון של קצות ה- DNA. כדי לשבט קטע גנים לווקטור, הן ה- DNA של הפלסמיד והן הוספת הגן נחתכים בדרך כלל עם אותם אנזימי הגבלה, ולאחר מכן מודבקים יחד בעזרת אנזים המכונה DNA ליגאז. [62] [63]

ניתן להשתמש באנזימי הגבלה גם כדי להבחין באללים גנטיים על ידי זיהוי ספציפי של שינויי בסיס יחיד ב- DNA המכונה פולימורפיזם חד-נוקלאוטיד (SNP). [64] [65] אולם הדבר אפשרי רק אם SNP משנה את אתר ההגבלה הקיים באלל. בשיטה זו, ניתן להשתמש באנזים ההגבלה כדי ליצור גנוטיפ לדגימת DNA ללא צורך ברצף גנים יקר. הדגימה מתעכלת תחילה עם אנזים ההגבלה ליצירת שברי DNA, ולאחר מכן את השברים בגדלים שונים המופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. באופן כללי, אללים עם אתרי הגבלה נכונים ייצרו שתי רצועות DNA גלויים על הג'ל, ואלו עם אתרי הגבלה משתנים לא ייחתכו וייצרו להקה אחת בלבד. ניתן לייצר גם מפת DNA על ידי הגבלת עיכול שיכולה לתת את המיקומים היחסיים של הגנים. [66] אורכי ה- DNA השונים הנוצרים על ידי עיכול הגבלה מייצרים גם דפוס ספציפי של להקות לאחר אלקטרופורזה של ג'ל, וניתן להשתמש בהן לטביעת אצבע DNA.

באופן דומה, אנזימי הגבלה משמשים לעיכול DNA גנומי לניתוח גנים על ידי כתם דרומי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לזהות כמה עותקים (או פרלוגים) של גן קיימים בגנום של אדם אחד, או כמה מוטציות גנים (פולימורפיזם) התרחשו בתוך אוכלוסייה. הדוגמה האחרונה נקראת פולימורפיזם באורך שברי הגבלה (RFLP). [67]

אנזימי הגבלה מלאכותיים הנוצרים על ידי קישור בין פוקתחום מחשוף ה- DNA עם מערך של חלבונים המחייבים DNA או מערכי אצבעות אבץ, המסומנים בגרעיני אצבעות אבץ (ZFN), הם כלי רב עוצמה לעריכת הגנום המארח בשל סגוליות הרצף המשופרת שלהם. ZFN עובדים בזוגות, כאשר הדימריזציה שלהם מתווכת במקום באמצעות ה פוקאני תחום. כל מערך אצבעות אבץ (ZFA) מסוגל לזהות 9–12 זוגות בסיס, מה שהופך 18–24 לזוג. מרווח בין 5-7 bp בין אתרי המחשוף משפר עוד יותר את הספציפיות של ZFN, מה שהופך אותם לכלי בטוח ומדויק יותר שניתן ליישם בבני אדם. נערך לאחרונה ניסוי קליני שלב א 'ב- ZFN לביטול ממוקד של הקולטן המשותף ל- CCR5 ל- HIV-1. [68]

אחרים הציעו להשתמש במערכת החיידקים R-M כמודל לתכנון חיסונים וטיפולים גנומיים אנושיים או טיפולים גנומיים מאחר ומערכת RM משרתת תפקיד הגנה מולד בחיידקים על ידי הגבלת הטרופיזם על ידי בקטריופאגים. [69] קיים מחקר על REases ו- ZFN שיכולים לדבוק את ה- DNA של וירוסים אנושיים שונים, כולל HSV-2, HPVs בסיכון גבוה ו- HIV-1, במטרה סופית לעורר מוטגנזה של היעד וסטייה של וירוסים שנדבקים באדם. [70] [71] [72] הגנום האנושי כבר מכיל שרידים של גנום רטרו-ויראלי אשר הופעל ורתם לרווח עצמי. ואכן נראה כי מנגנוני השתקת הרטומים הגנומיים הפעילים של L1 על ידי שלושת אקסונוקלאז 1 (TREX1) ותיקון צלב משלים 1 (ERCC) מחקים את הפעולה של מערכות RM בחיידקים, וההצטרפות הקצה הלא הומולוגית ( NHEJ) העוקב אחר השימוש ב- ZFN ללא תבנית תיקון. [73] [74]


חלק 2: בתוך מכונת שחבור RNA

00: 00: 07.19 אני אנה מארי פייל מאוניברסיטת ייל
00: 00: 09.27 והיום אני הולך לספר לכם על המבנה
00: 00: 12.20 והפונקציה של מכונת שחבור RNA,
00: 00: 15.10 שהיא מולקולת RNA שיכולה לחתוך באופן קטליטי
00: 00: 18.15 ולשנות חלקים של RNA, לתפור אותם יחד.
00: 00: 24.28 המכונה שאני מתכוון להתמקד בה היום נקראת אינטרון שחבור עצמי של קבוצת II
00: 00: 29.03 והמולקולה הזו היא ריבוזים מאוד מאוד, או RNA קטליטי,
00: 00: 33.19 שיכולה לזרז את השיחול שלו ואת השינוי שלו,
00: 00: 37.02 מה שאומר לקפוץ חזרה לאתרי שחבורים קודמים.
00: 00: 41.09 ואלו אנזימים מאוד מאוד גדולים
00: 00: 44.01 והם בין הריבוזימים הגדולים ביותר בטבע.
00: 00: 47.27 וכפי שאתה יכול לראות כאן,
00: 00: 49.09 זוהי התגובה שהם מזרזים - היא עוברת שני שלבים.
00: 00: 52.21 בשלב הראשון, האינטרון מתקפל למבנה
00: 00: 56.11 שיכול לזרז את תגובת השחבור,
00: 00: 59.18 המתווכת על ידי מים,
00: 01: 01.12 או קבוצת 2 'הידרוקסיל (2'-OH) של אדנוזין בתוך האינטרון.
00: 01: 05.15 לאחר השלב הזה, אתה מקבל ביניים גדול,
00: 01: 09.00 בשלב השני של השחבור,
00: 01: 10.16 קבוצת 3'-OH של אתר ה- splice 5 'שוב תוקפת,
00: 01: 14.22 שחרור אינטרון לאריאט ואקסונים קשורים.
00: 01: 19.07 זה אמור להיראות לכם מוכר
00: 01: 20.13 מכיוון שזו אותה תגובה שהיא מזרזת
00: 01: 23.12 על ידי הספליטוסום הגרעיני שלך,
00: 01: 25.06 שהיא מכונת השחבור החשובה לעיבוד כל ה- RNA שלנו.
00: 01: 30.14 כדי לשים את זה בפרספקטיבה,
00: 01: 32.10 מבינים שרוב ה- pre-mRNA שלך, או הודעות קודמות,
00: 01: 37.15 יש עד 10 אינטרונים ולפעמים יותר.
00: 01: 40.29 ואת אלה יש להסיר באמצעות הפונקציה של הסליסוסום שלך.
00: 01: 44.16 אז חשוב מאוד שנבין את הספציפיות
00: 01: 47.02 והמנגנון של תגובה זו.
00: 01: 50.02 כמודל מודל,
00: 01: 50.25 התמקדתי במערכת השחזור העצמי של קבוצת II intron.
00: 01: 55.03 ההבדל בין מערכות אלה הוא המבנה המקופל
00: 01: 58.07 של האינטרון עצמו מזרזת תגובה זו
00: 02: 01.25 בהיעדר חלבונים כלשהם,
00: 02: 03.25 ואילו הספליטוזום דורש מאות חלבונים
00: 02: 07.23 וסט מולקולות RNA שמורות מאוד
00: 02: 09.28 כדי לזרז את אותה תגובה.
00: 02: 12.08 אז הן מערכות מקבילות שימושיות להבנת מכניקה של שחבור.
00: 02: 19.21 אז בואו נתמקד קצת יותר איך נראים אינטרונים של קבוצה II:
00: 02: 23.02 ארכיטקטורת התחום והמבנה המשני שלהם מורכב משישה גזעים או תחומים
00: 02: 27.27 שמקרינים החוצה מגלגל מרכזי כך.
00: 02: 31.13 דומיין 1, או התחום הגדול ביותר,
00: 02: 33.14 תמיד מתועתק ומקופל תחילה
00: 02: 36.23 וזה סוג של תחום הפיגומים שאליו עוגנים כל התחומים האחרים.
00: 02: 40.28 הוא מכיל גם רצפים לזיהוי מטרות
00: 02: 44.08 שהיא תתקוף ותדבק,
00: 02: 46.02 במיוחד אקסון 5 'משלו.
00: 02: 49.10 התחומים האחרים אינם קריטיים לקטליזה,
00: 02: 52.03 אבל החלק החשוב ביותר באינטרון של קבוצה II
00: 02: 54.20 הוא הלולאה הקטנה של סיכת השיער כאן שנקראת דומיין 5.
00: 02: 58.16 זהו החלק היחיד של אינטרון של קבוצה II
00: 03: 00.29 כמעט בלתי משתנה בין המינים השונים
00: 03: 03.25 וזה מעניין כי אינטרונים של קבוצה II הם מולקולות ענק.
00: 03: 07.20 הם בגודל 400-1000 נוקלאוטידים
00: 03: 10.23 וזה אירוני שרק 34 הנוקלאוטיד הזה כאן
00: 03: 14.20 היא התכונה השמורה ביותר שלה.
00: 03: 17.16 חלק חשוב נוסף של אינטרון קבוצה II הוא תחום 6,
00: 03: 20.12 וזה התחום המכיל את האדנוזין
00: 03: 22.28 הנושא את הנוקלאופיל לשלב הראשון של שחבור.
00: 03: 26.15 אינטרונים רבים מקבוצה II, לעומת זאת, משתמשים במים כנוקלאופיל לשלב הראשון.
00: 03: 31.11 אז זו התוכנית הארגונית הבסיסית של אינטרון קבוצה II.
00: 03: 36.03 מה מנגנון התגובה שלהם?
00: 03: 38.03 ובכן הם מזרזים תגובת SN2 פשוטה מאוד,
00: 03: 41.11 שהוא התקף נוקלאופילי בשורה,
00: 03: 43.18 לפיו אלכוהול, שהוא קבוצת ה- 2'-OH
00: 03: 48.23 ריבוזה נוספת, או מים,
00: 03: 50.27 תוקפים בשורה על הפוספט הזה,
00: 03: 53.05 נותן לך ביניים דו -פירמידליות טריגונליות
00: 03: 57.07 ושחרור קבוצה זו של פוספט וקבוצת 3'-OH
00: 04: 01.06 עם היפוך התצורה.
00: 04: 03.29 שימוש בטכניקות של ביולוגיה כימית,
00: 04: 05.27 ג'ו פיקסירי הבין שזו תגובה
00: 04: 09.28 המזרז על ידי יוני מתכת בליבת האינטרון של קבוצת II.
00: 04: 14.26 וכך אינטרונים של קבוצה II, כמו ריבוזימים רבים,
00: 04: 17.07 אבל לא כולם,
00: 04: 17.22 הוא מטלואנזים והוא משתמש במתכות בצורה הבאה.
00: 04: 23.25 הוא הראה שמגנזיום מתאם את הקבוצה העוזבת
00: 04: 26.26 והנוקליאופיל
00: 04: 27.28 לייצוב הצטברות המטען השלילי
00: 04: 30.23 במצב מעבר זה.
00: 04: 33.03 אז זו תגובה פשוטה יחסית
00: 04: 34.27 וזו כמעט אותה תגובה גם בשלב הראשון וגם בשלב השני
00: 04: 37.26 של שחבור.
00: 04: 42.10 אז, ידענו את תוכנית הגוף הבסיסית של ה- RNA הללו
00: 04: 44.20 וידענו איזו תגובה הם מזרזים,
00: 04: 47.12 אבל לא ממש הבנו את המנגנון המדויק של קטליזה כימית.
00: 04: 51.19 וידענו גם שה- RNA הזה סביר
00: 04: 53.22 לכל מיני מוטיבים מבניים שלישוניים מעניינים.
00: 04: 57.24 אז אם רצינו להבין את הארכיטקטורה של המולקולה הזו
00: 05: 00.27 והמנגנון המדויק שלו,
00: 05: 03.00 היינו צריכים מבנה קריסטל ברזולוציה גבוהה.
00: 05: 06.18 אז בעצם, מה שהיינו צריכים כדי להיות מסוגל היה לצאת מהמבנה המשני,
00: 05: 10.25 או מפת roadkill של המולקולה, כפי שאני אוהב לקרוא לה,
00: 05: 14.06 למבנה השלישי.
00: 05: 16.12 ואני אספר לכם קצת על המסע הזה
00: 05: 18.15 וכיצד התחלנו לדמיין את ליבה של מכונת שחבור.
00: 05: 25.01 הכל התחיל בזיהוי אינטרון של קבוצה II
00: 05: 28.02 שיתגבש בקלות.
00: 05: 29.28 וחיפשנו את המולקולה הזו במשך כעשר שנים,
00: 05: 32.24 מסתכלים על סוגים רבים ושונים של אינטרונים של קבוצה II
00: 05: 35.08 ומנסה למצוא אחד שהיה יציב ומתגבש בצורה יוצאת דופן.
00: 05: 39.09 סוף סוף מצאנו אחד שמתגבש בקלות
00: 05: 42.29 ברצף ה- eubacterium Oceanobacillus iheyensis.
00: 05: 47.07 וכאשר תמללנו את המולקולה הזו,
00: 05: 49.01 גילינו שהוא ניפץ וייצב את עצמו
00: 05: 51.20 ביונים ובטמפרטורות נמוכות מאוד של מגנזיום.
00: 05: 56.08 וכך היה מועמד מבטיח.
00: 05: 59.27 לאחר מכן המשכנו לייצר כ -120 מבנים שונים של מולקולה זו
00: 06: 04.20 על מנת לנסות לארוז אותו
00: 06: 07.11 ועשו גבישים יפים
00: 06: 09.01 שממנו נוכל לפתור את המבנה.
00: 06: 12.07 ומספר 87, מכל המבנים האלה,
00: 06: 14.27 התגבש לבסוף לרזולוציית 3.1 אנגסטרום,
00: 06: 18.11 הנמצא בטווח היעד לפתרון המבנה.
00: 06: 21.04 ורק כדי להראות לך כיצד שינינו את המולקולה הזו
00: 06: 23.23 לשיפור ההתגבשות בהדרגה,
00: 06: 25.17 עליך לדעת ששינינו את אורכי כל הגבעולים השונים האלה,
00: 06: 29.00 הרכב הלולאה,
00: 06: 30.25 שינה הרבה מאוד דברים שונים
00: 06: 32.12 כדי לייעל את האריזה והתגבשות של המולקולה.
00: 06: 37.10 אז לבסוף, עם השגת רמת האיכות של הגביש,
00: 06: 43.03 הצלחנו לפתור את המבנה שלו באמצעות קריסטלוגרפיה של רנטגן.
00: 06: 47.07 והסיבה שאני אוהב להראות לכם את הנתון הזה,
00: 06: 49.07 הממחישה את צפיפות האלקטרונים של האינטרון Oceanobacillus,
00: 06: 53.28 הוא להראות לך את זה,
00: 06: 55.03 כשאתה רק מציץ בפעם הראשונה את צפיפות האלקטרונים,
00: 06: 58.09 או הפלט מהניסוי הקריסטלוגרפי,
00: 07: 00.22 אתה יכול לראות את הסלילים היפים הניכרים
00: 07: 04.06 ואתה יכול לראות את התוכנית הכוללת של המולקולה טוב מאוד
00: 07: 07.22 במקרה של RNA.
00: 07: 09.07 בחלבונים לרוב קשה יותר לראות
00: 07: 11.19 המאפיינים המבניים המשניים מאשר ב- RNA.
00: 07: 16.18 אז זה היה המחשה להצצה הראשונה שלנו למולקולה הזו.
00: 07: 21.14 כאשר סוף סוף הצלחנו לדגמן את כל הנוקלאוטידים במפה הזו,
00: 07: 26.08 הצלחנו בעצם לפתור את המבנה השלם של אינטרון זה.
00: 07: 32.00 ואתה יכול לראות מיד מהעטלף שזו צורה כדורי להפליא.
00: 07: 37.01 זהו סליל כפול לא פשוט
00: 07: 38.14 וזו לא סדרת גדילים לא מסודרת,
00: 07: 40.26 מדובר במולקולה כדורית קומפקטית מאוד,
00: 07: 43.09 כפי שאתה חושב על חלבון כדורי.
00: 07: 46.03 ויש מספר מאפיינים אדריכליים שכדאי לשים לב אליהם
00: 07: 49.10 ואני אתמקד בזה ברגע.
00: 07: 51.24 אבל אתה יכול לראות שיש כאן מעין פיגום למעלה,
00: 07: 56.13 והוא יוצר חלל שאליו נכנס האתר הפעיל.
00: 08: 00.26 האתר הפעיל הוא הדופלקס האדום הזה,
00: 08: 03.26 וזה התחום 5 שעליו דיברתי איתך בעבר.
00: 08: 06.27 ה- RNA שמור מאוד מאוד
00: 08: 09.06 שאנו מכירים זמן מה צפוי להיות האתר הפעיל.
00: 08: 12.21, ומעניין, הסלילים האלה שמציפים את הקצוות כאן,
00: 08: 18.16 אלה מכילים לעתים קרובות מרחבים שבהם אינטרונים של קבוצה II יכולים לקודד
00: 08: 21.28 מסגרות קריאה פתוחות לחלבונים הנישאים בתוך רצף האינטרונים עצמו.
00: 08: 27.00 וזה מעניין כי אתה יכול לראות שאם ה- RNA הזה היה הרבה יותר גדול
00: 08: 31.19 הוא יתארך ולא יפריע
00: 08: 34.04 האתר הפעיל של הריבוזימים כפי שהוא מקופל כאן.
00: 08: 42.17 אז בהתבוננות קפדנית במולקולה הזו,
00: 08: 44.23 הצלחנו ללמוד הרבה דברים,
00: 08: 46.09 והדבר הראשון שאני הולך לספר לך עליו
00: 08: 49.05 כך היא הודיעה לנו על אינטראקציות שלישוניות
00: 08: 52.08 ותכונות מבניות שלישוניות ב- RNA.
00: 08: 54.26 היו הרבה מושגים חדשים שנחשפו על ידי מולקולה זו
00: 08: 57.11 ורובם היו בתוך תחום 1 של אינטרון.
00: 09: 01.20 נזכיר אמרתי שאותו תחום 5'-רוב של אינטרון של קבוצה II
00: 09: 05.04 מתקפל ראשון והוא מתקפל באופן אוטונומי
00: 09: 07.16 למבנה שלישוני ספציפי.
00: 09: 10.14 בתוך המבנה של אינטרון הקבוצה השנייה,
00: 09: 12.22 אנו יכולים לראות זאת כאן.
00: 09: 14.24 שאר האינטרון נעלמתי לאפור
00: 09: 17.04 כדי שתוכל להתמקד בדומיין 1 בכל הצבעים האלה.
00: 09: 22.11 בתוך התחום הזה נמצאים מספר מוטיבים מעניינים מאוד
00: 09: 24.11 ואני אראה לך כמה מהם.
00: 09: 27.25 לדוגמה, שניים מהם שאני אוהב להתמקד מוצגים כאן.
00: 09: 32.09 וכדי להראות לך היכן הם נמצאים במבנה,
00: 09: 35.07 והאזור הזה כאן במבנה המשני הוא צומת חמש כיוונים,
00: 09: 38.25 שכפי שאתה יכול לדמיין,
00: 09: 40.01 צריך לאמץ ארכיטקטורה די מורכבת עבור כל הסלילים האלה
00: 09: 44.03 כדי להצביע בכיוון הנכון וליצירת הקיפול השלישי.
00: 09: 48.02 אז, תן לי להראות לך את הצומת החמישי הזה במרחב התלת ממדי.
00: 09: 52.11 זהו המבנה הזה כאן.
00: 09: 55.00 זוהי קבוצה יוצאת דופן של אינטראקציות שלישוניות
00: 09: 57.16 ומוטיבים מחוברים.
00: 10: 00.18 המועדף עלי, למעלה, נקרא מוטיב T-loop,
00: 10: 03.23 ומה שאתה רואה הוא שהפנייה הכחולה הזו כאן
00: 10: 07.09 מזכיר מוטיב שאנו רואים לעתים קרובות במבנים,
00: 10: 11.21 נקרא טטרלופ של GNRA,
00: 10: 15.21 אבל זה כמעט כאילו יש בו חור:
00: 10: 18.01 חסר בסיס במיקום הזה
00: 10: 20.07 והוא מתמלא באדנוזין שמגיע
00: 10: 23.00 מהחלק האפור הזה של המולקולה.
00: 10: 25.02 אז, רוב ה- RNA הזה מוחזק יחד באותה הדרך
00: 10: 28.16 היה נבנה שולחן מיושן,
00: 10: 30.25 עם יתדות שמתאימות לחריצים ומחזיקות יחד
00: 10: 34.00 כל הפיגום בדרך זו,
00: 10: 35.27 והתייצבו בעיקר על ידי אינטראקציות של ערימות בסיס.
00: 10: 40.04 ותוכלו לראות יותר את אינטראקציות הערימה השמורות
00: 10: 43.14 ורשתות שנוצרות במיקום הזה כאן.
00: 10: 47.16 סוג אחר של חלק מועדף על המולקולה בשבילי נקרא עוגן Z.
00: 10: 52.01 ובמבנה המשני,
00: 10: 54.08 אנו יכולים לראות שזה המנגנון
00: 10: 57.03 שבאמצעותו הסליל הירוק הופך למעשה מקביל לחלוטין
00: 11: 02.09 עם הסליל הכתום, כאן, כפי שניתן לראות במבנה זה.
00: 11: 05.18 אז שתי הסלילים האלה צריכים להפוך זה לצד זה.
00: 11: 09.00 איך זה עובד?
00: 11: 10.24 שתי לולאות בתוכם מתמוססות בצורה הבאה.
00: 11: 14.25 אז הנה הסליל הכתום, הנה חלק מהסליל הירוק,
00: 11: 19.01 ומה שקורה עם התעוררות הסליל הכתום,
00: 11: 22.09 אתה רואה שאתה זוגות בסיס רגילים כאן למטה,
00: 11: 25.20 ואז אחד הבסיסים מתהפך החוצה
00: 11: 27.29 ובמקום ליצור זוג בסיס עם גדיל כתום אחר,
00: 11: 31.06 הוא יוצר זוג בסיס עם הגדיל הירוק.
00: 11: 34.00 השכן הבא שלו ניגש ויוצר זוג בסיס
00: 11: 36.24 עם עוד גדיל כתום,
00: 11: 38.14 ואז הבסיס הבא מתהפך שוב החוצה,
00: 11: 41.14 יוצרים זיגזג זה של חיבורים בין בסיסים לשני גדילים,
00: 11: 46.02 ולא קווצה אחת.
00: 11: 49.03 אז המבנה התלת-גדילי הזה הוא דרך מעניינת באמת
00: 11: 51.27 כי RNAs יכולים לגוון את ההכרה בחוט מרכזי.
00: 11: 59.09 סוג אחר של מושג לאומים ולברגים
00: 12: 01.29 לחיבור RNA שנחשף
00: 12: 04.08 ומודגם על ידי אינטרון הקבוצה השנייה
00: 12: 09.11 הוא מוטיב הרוכסן הריבוזי.
00: 12: 11.03 זה למעשה תואר לראשונה על ידי קייט ודודנה בשנת 1996
00: 12: 14.09 באחד המבנים הקריסטלוגרפיים הראשונים ברזולוציה גבוהה
00: 12: 17.16 של מולקולת RNA מורכבת.
00: 12: 20.16 ומה שהם הראו הוא הרעיון החשוב הזה:
00: 12: 24.11 שקבוצת 2'-OH של סוכר הריבוזה דביקה מאוד
00: 12: 27.07 ויכול ליצור קשרי מימן מפוצלים
00: 12: 29.28 שיכולות לסרוג גדילי RNA יחד.
00: 12: 32.23 אז אם יש לך גדיל RNA אחד כאן,
00: 12: 34.25 וגדיל RNA אחד כאן,
00: 12: 36.19 הם יכולים לבוא יחד
00: 12: 39.06 על ידי interdigitation של קבוצות 2'-OH שלהם.
00: 12: 42.23 וזה בדיוק מה שאנו רואים במקומות רבים בתוך אינטרון הקבוצה השנייה.
00: 12: 47.05 באופן ספציפי, כאן למעלה,
00: 12: 49.16 יש אינטראקציה של לולאת נשיקות לטווח ארוך שנקראת אלפא-אלפא ',
00: 12: 53.25 ואני מראה לכם את זוגות הבסיס האלה בייצוג הזה כאן,
00: 12: 58.15 בסוף אותה אינטראקציה,
00: 13: 00.07 גדילי ה- RNA מתקרבים זה לזה מאוד כפי שניתן לראות כאן.
00: 13: 04.19 וכשהם עושים זאת,
00: 13: 05.21 הם רוכסנים למעלה והריבוזות וקבוצות 2'-OH יוצרות רשת זו
00: 13: 11.20 המשמש להדבקת האנסמבל כולו.
00: 13: 18.21 אז דיברנו על האינטראקציות השלישוניות
00: 13: 20.25 שנחשפו על ידי המבנה המורכב הזה.
00: 13: 23.14 עכשיו אני רוצה לדבר איתך עוד קצת על מה שקורה
00: 13: 25.24 באתר הפעיל של האינטרון
00: 13: 28.02 וכיצד הוא מזרז כימיה.
00: 13: 30.29 אז אחד הדברים שהדהימו אותי הרבה זמן
00: 13: 33.00 כשהייתי בוהה במבנה המשני
00: 13: 36.13 ומאפיינים שימוריים של האינטרון של קבוצת II היו ש,
00: 13: 39.11 למרות שדומיין 5 היה שמור מאוד,
00: 13: 42.16 הייתה רמת שימור מוזרה וגבוהה
00: 13: 45.10 בצומת זה בין דומיינים 2 ו -3.
00: 13: 48.24 ותהיתי, מדוע נמצאים אותם נוקלאוטידים בודדים בצומת ההוא
00: 13: 52.16 נשמרת בדיוק כמו תחום 5.
00: 13: 55.15 והתשובה הגיעה מהמבנה שהתגלה
00: 13: 57.01 כי הסיבה שהם נשמרים לאותה רמה
00: 13: 59.29 הוא שהם חלק מאותה ישות מבנית.
00: 14: 03.12 אתה יכול לראות שצומת זה נכנס
00: 14: 05.08 ומחייב בחריץ העיקרי של הסליל האדום ההוא.
00: 14: 10.05 מקרוב, זה נראה בערך כך:
00: 14: 12.09 הוא יוצר סליל משולש יפהפה,
00: 14: 14.17 אז נוקלאוטידים צומת זה נכנסים
00: 14: 18.01 ויוצרים קשרי מימן עם קצה החריץ העיקרי
00: 14: 21.17 מהגזע התחתון של דומיין 5
00: 14: 24.05 ועוד אחד נוצר ממגזר אחר של תחום 5.
00: 14: 30.04 אז, הסליל המשולש הזה,
00: 14: 32.28 יחד עם נקישה חדה בעמוד השדרה של ה- RNA במיקום זה,
00: 14: 37.14 יוצרים פלטפורמת יון מתכת חזקה מאוד בתוך ליבת האינטרון של קבוצת II.
00: 14: 43.15 והסיבה שזה קורה היא שאתה יכול לדמיין כאן,
00: 14: 46.27 שיש הרבה מאוד פוספטים שמתחברים
00: 14: 50.02 בחלל מאוד מאוד קטן,
00: 14: 51.24 כך שהפוטנציאל האלקטרוסטטי באזור זה של המולקולה
00: 14: 55.02 הופך להיות קיצוני
00: 14: 56.28 וזה הופך להיות מאוד מאוד תורם
00: 14: 58.23 לקשירת יוני מתכת בנקודות ספציפיות.
00: 15: 02.00 ואכן אתה רואה
00: 15: 03.14 ששני קטיונים דו -מידתיים נקשרים במיקום זה
00: 15: 06.17 בדיוק 3.9 אנגסטרים זה מזה.
00: 15: 10.13 ולעתים קרובות זוהי חתימה לאנזימים
00: 15: 14.01 המזרזים מחשוף של ריבוז או דיוקסיריבוזה
00: 15: 18.14 באמצעות מנגנון יון דו -מתכתי.
00: 15: 23.12 אז, דרך העבודה והעבודה הנוספת שעשינו,
00: 15: 26.03 נודע לנו כי מתכות 1 ו -2 בעמדות אלה
00: 15: 30.01 הם אכן יוני המתכת הקטליטי הדרושים לריתוך,
00: 15: 33.26 בדיוק כפי שחזה ג'ו פיצ'רילי מניסויים בביולוגיה כימית.
00: 15: 37.29 והם עומדים ממש מעל הצמדה הדגימה
00: 15: 40.13 כדי לבקע את הקשר הזה על מצע מטרה.
00: 15: 45.10 אז זה היה מאוד מספק כי זה היה ברור
00: 15: 47.07 שהיה לנו מטלואנזים שהיה דומה במובנים מסוימים לאנזימים אחרים
00: 15: 51.28 ובכל זאת ידענו שזה לא הסיפור כולו.
00: 15: 55.05 וזה בגלל, ברזולוציה הקריסטלוגרפית
00: 15: 59.01 בה השתמשנו לחקר מולקולה זו,
00: 16: 01.02 ראינו צפיפות אלקטרונים נוספת המתיישבת עם יוני מתכת אחרים.
00: 16: 05.21 אבל הנתונים לא היו מספיק טובים כדי לפרש את עמדתם באופן חד משמעי.
00: 16: 09.22 אז עבדנו יותר קשה על זה,
00: 16: 11.26 הגדלת הרזולוציה ושימוש בפיזור חריג,
00: 16: 14.15 שהוא כלי לניקור המיקום של יוני מתכת.
00: 16: 19.25 באופן ספציפי, כששיפרנו את הרזולוציה של הגבישים שלנו,
00: 16: 24.07 ראינו שסביר מאוד שיש יוני מתכת
00: 16: 27.06 גם בעמדה הזו ובתפקיד הזה.
00: 16: 30.18 ובשל האופן שבו ה- RNA שמסביב התקשר איתם,
00: 16: 34.03 סביר מאוד שמדובר ביוני אשלגן.
00: 16: 37.09 אז זה הפתיע אותנו,
00: 16: 38.26 שיכולה להופיע קטיון חד -ערך פשוט
00: 16: 41.10 לשחק תפקיד כה חשוב באתר הפעיל.
00: 16: 45.02 בכדי באמת להצהיר על כך,
00: 16: 46.26 היינו צריכים לזהות את עמדתם באופן חד משמעי,
00: 16: 49.21 וזה נעשה על ידי החלפתם ביון כבד
00: 16: 52.26 המפריע צילומי רנטגן בצורה יוצאת דופן
00: 16: 56.20 וזה חיקוי טוב לאשלגן.
00: 16: 58.28 אז פתרנו עוד 14 מבני קריסטל
00: 17: 02.08 של האינטרון בכל צירופי המתכות השונים האלה.
00: 17: 06.09 ובפרט, אני מפנה את תשומת ליבך למצב זה,
00: 17: 09.01 בו הוחלף אשלגן בתליום
00: 17: 12.18 והמגנזיום נשמר על כנו.
00: 17: 15.06 ובמבנה הזה,
00: 17: 16.16 אתה יכול לראות ממפת הבדל
00: 17: 18.16 שהתאליום תופס את העמדות המדויקות
00: 17: 22.23 שהשערנו שהן נתפסות באשלגן.
00: 17: 25.25 ובגלל הדמיון שלהם ברדיוס היוני ותפקודו
00: 17: 29.23 וגם הדמיון עם נתוני רובידיום מקבילים,
00: 17: 32.23 שעושה את אותו הדבר,
00: 17: 34.16 הבנו שסיימנו לאשלגן
00: 17: 37.09 כמרכיב חשוב באתר הפעיל.
00: 17: 43.00 אז במכלול המבנים הספציפי הזה,
00: 17: 46.00 הסתכלנו על האינטרון החופשי,
00: 17: 48.05 ללא כל מצע כבול,
00: 17: 50.06 ברזולוציה טובה סבירה.
00: 17: 52.09 ויכולנו לראות במקרה זה את התמונה הבאה:
00: 17: 55.08 יכולנו לראות שיש שני יוני מתכת דו -ערכיים
00: 18: 00.16 (בהעדר מצע הם תואמו עם מים)
00: 18: 01.14 והיה ברור שיש אשלגן שמאוד קרוב אליהם.
00: 18: 05.18 וקראנו לקרובים K1 ו- K2.
00: 18: 09.12 בדיקה מדוקדקת העלתה כי K1 הוא כמעט כמו אבן מפתח
00: 18: 13.08 להקמת אתר Metal 2 (M2).
00: 18: 16.03 אז יון המתכת הקטליטי הזה, שנדרש בהחלט לכימיה,
00: 18: 19.20 מתקיים במקום על ידי סידור ליגנדים
00: 18: 22.25 הממוקמים על ידי אשלגן זה.
00: 18: 25.16 ומבנים מאוחרים יותר הראו,
00: 18: 27.03 כפי שאני אספר לך עוד רגע,
00: 18: 28.29 אם אתה מבלבל את האתר הזה באמצעות מוטציה
00: 18: 33.00 או החלפה ביון מתכת בגודל לא נכון,
00: 18: 35.14 מתכת 2 לא נקשרת והיא הורגת את הריבוזים.
00: 18: 41.14 אז זה היה רק ​​ניסוי שליטה לספר לנו
00: 18: 43.17 שבכל היונים המתפזרים המוזרים, החריגים האלה,
00: 18: 46.29 אם עדיין קיבלנו כימיה של ריבוזים.
00: 18: 50.26 אז זהו המצב הרגיל,
00: 18: 52.23 שבו אתה רואה RNA מבשר להידבק לשבר האינטרון ולשברים אקזוניים.
00: 18: 58.24 וכאן אתה יכול לראות שבתאליום,
00: 19: 01.02 זה כמעט מאושר יותר: אתה רואה את המבשר הולך לאינטרון והרכיבים האקסוניים,
00: 19: 06.17 ואפילו דרך מצב ביניים,
00: 19: 08.06 בקצב מהיר יותר מאשר במקרה האשלגן.
00: 19: 10.18 אז אפילו בתליום ובמגנזיום בלבד,
00: 19: 12.28 זהו אנזים שמח מאוד,
00: 19: 14.21 אז הגיוני שתליום מחליף את אתרי האשלגן.
00: 19: 20.11 אז כל מה שהראתי לך עד כה היה במצב המוצר של האינטרון.
00: 19: 25.27 זהו מצב רלוונטי מבחינה ביולוגית
00: 19: 28.09 מכיוון שהאינטרון החופשי הזה מסוגל לבצע שחבור הפוך
00: 19: 32.16 לתוך RNAs ברצף דומה ואפילו ל- DNA.
00: 19: 36.14 אז זה כן משנה,
00: 19: 37.29 אך יחד עם זאת סקרן אותי מאוד
00: 19: 39.29 תפקידו של האתר הפעיל בחיבור,
00: 19: 42.20 ורציתי לדמיין את השלב הראשון של שחבור.
00: 19: 45.21 כדי להסתכל על שחבורות, עליך להיות בעל אקסון של 5 '
00: 19: 48.04 שמחובר לתחום הראשון של האינטרון.
00: 19: 51.19 אז אם כי זה היה המבנה
00: 19: 52.24 ששימש למידע שסיפרתי לך עליו בעבר,
00: 19: 56.29 היינו צריכים ליצור אחד חדש
00: 19: 58.13 ולפתור מכלול מבנים חדש לגמרי
00: 20: 01.25 עם האקסון 5 'מצורף.
00: 20: 03.18 ועשינו את זה.
00: 20: 06.07 כמו כן, בנוכחות כל אותם יוני מתכת יוצאי דופן.
00: 20: 09.28 ואתה רואה את הדבר המעניין הבא
00: 20: 11.29 כאשר יש לך את האקסון 5 'המצורף:
00: 20: 14.20 אתה יכול לראות את קישור הדיים, שם הכימיה הולכת לקרות,
00: 20: 17.20 מוכנסים ממש מעל יוני המגנזיום הקטליטי
00: 20: 21.18 ותוכלו לראות את הפוספט הדקסי מוכן
00: 20: 23.13 להותקף על ידי מים נוקליאופיים,
00: 20: 25.29 שגם אותו יכולנו לצפות.
00: 20: 28.24 ותוכלו לראות את שני האשלגן
00: 20: 30.13 ממלאים את תפקידיהם החשובים בתמיכה באתר הפעיל.
00: 20: 33.24 השגנו את המבנה הזה בנוכחות סידן
00: 20: 36.22 ובמצב מסוים זה, הפוספט אינו נבקע.
00: 20: 40.03 אבל כשמוסיפים מגנזיום,
00: 20: 42.12 אתה רואה מחשוף
00: 20: 43.25 ואתה רואה את הפוספט המבוקע נודד
00: 20: 46.05 מעמדה זו עוברת לאשלגן 2.
00: 20: 49.27 אז זה אומר לנו שאשלגן 2 ממלא תפקיד מרכזי במנגנון:
00: 20: 53.26 חשוב להתייצב
00: 20: 55.18 התוצר של תגובת השלב הראשון.
00: 20: 58.12 כך שלכל יון מתכת יש תפקיד חשוב בכל התהליך.
00: 21: 06.05 אז בדיוק סיפרתי לכם על K1 ו- K2,
00: 21: 07.29 M1 ו- M2,
00: 21: 09.09 אבל אל תתנו לזה לגרום לכם לחשוב
00: 21: 11.18 שאלו המתכות החשובות היחידות במבנה.
00: 21: 14.13 אלה הם החשובים ביותר לכימיה,
00: 21: 16.21 אבל עבודה נוספת שעשינו בנושא תפוסת יונים ממתכת
00: 21: 20.22 בכל ה- RNA הזה מראה לנו שיש הרבה מאוד יוני מתכת
00: 21: 24.29 עם תפוסה גבוהה בכל ה- RNA הזה
00: 21: 27.24 ותומכים במוטיבים השונים של המבנה השלישי.
00: 21: 31.28 יוני מתכת ממלאים תפקיד חיוני בארגון מולקולות ה- RNA
00: 21: 36.28 ולכן אנו ממשיכים לחקור גם אותם.
00: 21: 43.12 אז מה למדנו עד כה?
00: 21: 46.05 האינטרון לימד אותנו על מנגנון שחבור לפני mRNA ברמה הכימית,
00: 21: 50.07 אבל זה גם חשף כמה רעיונות חדשים על RNA כזרז.
00: 21: 54.18 זה הראה לנו את המושגים הבאים:
00: 21: 57.03 כי לא רק יונים דו -ערכיים חשובים לכימיה של ריבוזים,
00: 22: 01.19 יונים חד -ערךיים יכולים לשחק תפקיד גם כן,
00: 22: 04.13 ואשלגן חשוב במיוחד הן במבנה והן בקטליזה.
00: 22: 09.29 במהלך שחבור אינטרונים של קבוצה II,
00: 22: 11.14 אנו רואים שאשלגן 1 ו -2 כל אחד ממלא תפקיד
00: 22: 14.24 במנגנון החשוב.
00: 22: 16.26 אז זה אומר שאינטרונים של קבוצה II,
00: 22: 18.00 ואולי ריבוזימים אחרים,
00: 22: 19.22 הם לא שני אנזימי יון מתכת פשוטים.
00: 22: 23.00 למעשה, בדומה לאנזימי חלבון,
00: 22: 24.18 ייתכן שהם משתמשים באשכולות מתכת,
00: 22: 26.26 שהיא מופע מאוד מאוד נפוץ בעולם החלבונים.
00: 22: 30.23 אז, אשכולות מתכת הטרו -גרעיניים המורכבים מסוגים שונים של יונים,
00: 22: 34.13 יכול להיות נושא חשוב.
00: 22: 37.19 וזה גם מביא אותנו לעובדה שכאשר אתה מוסיף
00: 22: 40.01 האתר הפעיל של האינטרון של קבוצת II עם אנזימי חלבון,
00: 22: 43.07 אתה יכול לראות הקבלות חשובות
00: 22: 44.13 באופן בו הם עושים כימיה.
00: 22: 49.13 אז עכשיו אני אספר לכם קצת על
00: 22: 51.11 מה שלמדנו מצורת הנתרן של מבנה זה,
00: 22: 54.23 כי זה גילה לנו בפעם הראשונה שיש
00: 22: 57.26 קונפורמציה חלופית בתוך האתר intron active של קבוצת II.
00: 23: 01.14 ואספר לך כיצד אנו מפרשים זאת.
00: 23: 05.00 אז, אנחנו יודעים מזה זמן רב שאם יצרת בטעות את המאגרים שלך,
00: 23: 08.18 או הוספת נתרן כלשהו לתגובה הכרוכה בכך
00: 23: 11.22 כל אחד מהאינטרונים של קבוצה II איתם עבדנו,
00: 23: 14.05 אתה לא רואה שום כימיה של תגובה.
00: 23: 15.24 אינך רואה שחבורות.
00: 23: 17.17 אז זה הגיוני מכיוון שלנתרן אין אותו רדיוס יוני כמו לאשלגן
00: 23: 21.16 והוא אינו מתאים לאתרי אשלגן.
00: 23: 24.12 ובוודאי, אנו רואים שצורת הנתרן של האינטרון
00: 23: 27.11 מאמצת קונפורמציה חלופית לאתר פעיל.
00: 23: 32.14 אנו רואים מה שנראה כמחליף קונפורמטיבי
00: 23: 35.01 בין שני שלבי הריתוך הכוללים סיבוב של שני בסיסים,
00: 23: 39.11 אחד כאן ואחד כאן.
00: 23: 42.14 מה שאנו רואים הוא שבצורה הקודמת של האינטרון,
00: 23: 44.24 יש לך את הטריפלקס החריץ הגדול הזה למטה
00: 23: 47.29 ויש לך את הפנייה ההדוקה הזו בעמוד השדרה של ה- RNA,
00: 23: 50.20 ובצורת הנתרן, שניים מהבסיסים האלה התהפכו.
00: 23: 54.22 במקרה אחד, 70 מעלות
00: 23: 56.05 ובמקרה אחד אחת ממולקולות הגואנוזין הקטליטי
00: 23: 59.21 עובר מהעמדה הזו עד לכאן,
00: 24: 02.17 כעת אינטראקציה עם תחום אחר לגמרי: דומיין 3.
00: 24: 06.26 כאשר מתרחש סידור ארכיטקטוני מסוג זה,
00: 24: 10.02 יוני המתכת באתר הפעיל למעשה עוזבים
00: 24: 13.02 וזה יוצר חור פתוח גדול בתוך האתר הפעיל.
00: 24: 17.02 זה ממש הכרחי
00: 24: 18.08 כי בין שלבי השחבור
00: 24: 21.02 המגיבים לשלב הראשון צריכים לצאת מהדרך
00: 24: 23.24 והמגיבים לשלב השני צריכים להיכנס.
00: 24: 26.10 ולכן שיערנו שזה יכול להיות
00: 24: 29.10 הסידור מחדש שחייב להתרחש בין השלבים
00: 24: 32.03 כך שתוכל לעבור את השינויים הדרושים
00: 24: 34.04 כדי לעורר את השלב השני של שחבור ולהשלים את התהליך.
00: 24: 38.15 אז אם אתה מדמיין את שחבורת האינטרונים של קבוצה II
00: 24: 40.29 מתרחש בשני השלבים האלה, כפי שהסברתי קודם,
00: 24: 44.11 מקרוב הוא עשוי להתרחש באופן הבא.
00: 24: 47.14 אנו יודעים כי סידור האתר הפעיל, קודם לכן,
00: 24: 51.00 וממש אחרי השלב הראשון של שחבור,
00: 24: 52.29 נראה בערך כך,
00: 24: 54.11 עם שתי יוני המתכות הקטליטיות והאשלגן התומך.
00: 24: 58.19 והשערנו כי ביניים
00: 25: 01.05 בין שתי המדינות כרוכה בסיבוב של שני בסיסים.
00: 25: 06.18 לאחר שהדבר מתרחש והשלב השני של שחבור מוגדר,
00: 25: 09.22 תקבל רפורמה באתר הפעיל
00: 25: 13.05 ויוני המתכת, וחוזרים למצב ההתחלה.
00: 25: 20.16 אז אם נחשוב על ארגון האתר הפעיל
00: 25: 24.22 לשלב הראשון של שחבור,
00: 25: 26.08 כלומר האתר המוסמך לכימיה,
00: 25: 30.10 הצלחנו לקחת את המידע הזה
00: 25: 33.12 ולמד הרבה על האבולוציה של שחבור
00: 25: 37.18 באיקריוטים.
00: 25: 40.03 והסיבה לכך היא שמבנה האינטרון של קבוצת II
00: 25: 43.02 שימשה מעין מפת דרכים למחשבה כיצד הארכיטקטורה
00: 25: 46.16 של הספליטוזום האאוקריוטי עשוי להיות מאורגן.
00: 25: 50.21 והסיבה שאני חושב שזה הדבר הבא.
00: 25: 53.14 דומיין 5, המוטיב השמור ביותר המכיל את כל רכיבי האתר הפעילים,
00: 25: 58.10 מוצג כאן במבנה משני כזה.
00: 26: 01.16 ואלו, בקווים מנוקדים,
00: 26: 03.11 הצביעו על האינטראקציות השלישוניות שהתגלו על ידי מבנה הגבישים שלנו.
00: 26: 08.01 ואנו יודעים במקרה שזו אחת ממולקולות ה- RNA שנשמרו באמת
00: 26: 12.05 ב- spliceosome שלך,
00: 26: 13.13 נקרא R6 גרעיני קטן U6,
00: 26: 16.00 יש מבנה משני שתמיד הזכיר מאוד את תחום 5 באינטרונים של קבוצה II,
00: 26: 22.05 ובמשך שנים רבות אנשים שיערו שיש ביניהם דמיון.
00: 26: 25.11 הם אפילו קשרו שני יוני מתכת במקומות דומים.
00: 26: 29.11 אבל המבנה שפתרנו
00: 26: 31.17 הציע כי חלק מ- U6
00: 26: 33.19 יכול ליצור את אותן אינטראקציות מולקולריות
00: 26: 36.03 שראינו באינטרון של קבוצה II.
00: 26: 39.14 ועבודות אחרונות של מעבדותיו של ג'ו פיקסירי
00: 26: 42.18 וג'ון סטאהלי מאוניברסיטת שיקגו,
00: 26: 45.08 באמצעות RNAs spliceosomal,
00: 26: 48.02 אכן הוכיחו כי האתר הפעיל spliceosomal
00: 26: 50.26 נראה מאוד מאוד דומה לקבוצה השנייה.
00: 26: 53.24 ולמעשה, כי M1 ו- M2 של הספליטוסום
00: 26: 57.02 ממוקמים באותו אופן,
00: 26: 58.28 ועל פי הבסיסים הצפויים,
00: 27: 00.12 כפי שנצפה באינטרון של קבוצה II.
00: 27: 03.08 אז זה מרגש כי זה אומר ש,
00: 27: 05.19 כפי שנחזה מזמן,
00: 27: 07.29 כי אינטרונים של קבוצה II והספליטוסום
00: 27: 09.20 עשוי לשתף אב קדמון אבולוציוני משותף.
00: 27: 15.04 אז לסיום,
00: 27: 17.28 באמצעות מחקרים על האינטרונים של קבוצת Oceanobacillus II,
00: 27: 20.17 דמיינו את המבנה והאתר הפעיל של מכונת שחבור RNA,
00: 27: 24.21 זיהינו את יוני המתכת שבליבה של קבוצה II,
00: 27: 27.21 מציאת תפקידים חשובים הן עבור חד -ממדיות והן של דיוולנטים
00: 27: 30.18 במבנה וכימיה.
00: 27: 32.24 ריבוזים זה משתמש באשכול יונים מתכתי חדש,
00: 27: 35.25 כלומר כימיה של RNA אינה שונה מכימיה של חלבונים.
00: 27: 40.02 אשכול המתכת שלם גם ללא המצע,
00: 27: 42.21 כלומר כמעט לאנזים הזה יש שיניים
00: 27: 45.08 וזה הגיוני כי אינטרונים של קבוצה II הם רכיבים רטרו שיכולים לתקוף DNA.
00: 27: 51.04 ואנו מאמינים שראינו החלפה מבנית
00: 27: 53.06 בין שני השלבים של שחבור
00: 27: 55.02 וכי נוכל להתחיל לאפיין את תכונותיו.
00: 27: 58.25 ובגלל עבודתם של אחרים,
00: 28: 00.11 עכשיו ברור שקבוצות II אינטרונים והספליטוסום
00: 28: 03.03 יש אתר פעיל כמעט זהה.
00: 28: 06.15 אז המבנה של קבוצה II ממש עזר
00: 28: 07.27 כי זה לימד אותנו על כימיה, מבנה ואבולוציה.
00: 28: 12.29 אז כל העבודה הזאת נעשתה על ידי שלושה אנשים מוכשרים מאוד:
00: 28: 16.19 Nav Toor,
00: 28: 17.29 מרקו מרסיה,
00: 28: 19.09 וקווין קיטינג,
00: 28: 20.11 בסיוע רב של ראג 'ראג'שנקר
00: 28: 22.12 ואולגה פדורובה.
00: 28: 23.09 ואני מאוד חייב לאנשים האלה על העבודה הקשה והמסירות שלהם.
00: 28: 26.26 ותודה רבה על ההאזנה למצגת הזו.


רקע כללי

עולם ה- RNA הוא תקופה אבולוציונית עתיקה המאופיינת בחילוף חומרים המבוסס על ריבוזים. הוא חשב שהקוד הגנטי, או לפחות מבשרי המתאמים המודרניים (כלומר tRNAs, איורים 1 ו -2), הוקמו בשלב זה [[1], Ch. 5]. ישנן מספר תיאוריות המסבירות את ארגון הקוד הנוכחי במונחים של יתרונות סלקטיביים, חוסן נגד מוטציה, העברת גנים לרוחב, תכונות ביוכימיות ופיסיקליות-וכימיות וכן הלאה. רוב הרעיונות הללו נובעים מההנחה שקודמים קודמים, אולי פחות מדויקים או מורכבים, שהתפתחו על ידי בחירה על עקרונות ארגוניים שונים, שהובילו לקוד הגנטי המודרני. בעוד שרוב התיאוריות עוסקות בסידורים מחדש של הקוד, רק מעטים מתייחסים ישירות לשאלה כיצד צץ קוד זה. במידה מסוימת, ניתן להסביר את הקשר הספציפי בין חומצות אמינו מסוימות לקודונים שלהן על ידי היווצרות קומפלקסים קוולנטיים של דינוקליאוטידים ומקדמים לחומצות אמינו [2]. רעיונות נוספים שזכו לתשומת לב רבה יותר הם הטיעונים הסטריאוכימיים (הזיקה המבנית בין חומצות אמינו לשלישיות קידוד) [3-6]. יתר על כן, הוצע כי תפקידן של חומצות אמינו בעולם RNA הוא לשפר את הפעילות הקטליטית של ריבוזימים [7], פונקציה הדורשת קידוד, מכיוון שנדרשים ריבוזימים לקשור את חומצת האמינו כקופקטורים באופן ספציפי.

מבנה בסיסי של מולקולת tRNA.

שלבי ההתפתחות של מולקולת tRNA. (א) במקור זה היה מורכב מטרינוקלאוטיד המחובר לחומצת אמינו (B) השלישייה התארכה למיני-סליל, כנראה מכיוון שהוא העניק יציבות מבנית (C) התארכות נוספת של המיני-סליל הביאה למבנה ה- tRNA המודרני. עבודה זו מוגדרת בשלב כמו ב- (B). לפרטים אודות מנגנוני ההתפתחות בפועל של מולקולת tRNA, ראו [6].

אני מציע שתפקיד עתיק חלופי לחומצות האמינו בעולם RNA קודם היה לקצור אנרגיה. אני מציע תרחיש בו נדרש קידוד על מנת לבצע את ההתפרקות הקטבולית של חומצות אמינו, ואשר עלה בקלות על ידי הקצאות אקראיות ראשונות.

טענתי נובעת משלוש תצפיות. ראשית, חומצות אמינו מפולות כדי להשיג אנרגיה, והמטבוליטים משמשים כמבואות ביו -מולקולות אחרות, תפקיד שמתעלמים ממנו לעתים קרובות בשל המיקום הבולט והמרכזי של החלבונים בחילוף החומרים. זה מצביע על כך שלחומצות האמינו היה יכול להיות תפקיד ביו -אנרגטי, במקום קטליטי, כאשר האחרונים יופיעו מאוחר יותר. בפרט, חיידקים מהסוג קלוסטרידיום ידועים כמשתמשים בחומצות אמינו ישירות לקצירת אנרגיה מטבולית. חלק מהנאירובים החייבים הללו אינם מעסיקים גלוקוז כמקור פחמן, אלא מתסיסים זוג מולקולות חומצת אמינו אחת פועלת כתורם אלקטרונים ואחרת פועלת כקולט אלקטרונים. התגובה הכוללת, נקראת תסיסת סטיקלנד משחרר אנרגיה המפעילה את ייצור ה- ATP (איור 3). המצעים לתגובת סטיקלנד הם זוגות ספציפיים של חומצות אמינו. כלומר, המגיבים צריכים לכלול חומצת אמינו אחת שניתן לחמצן (בדרך כלל אלאנין, ואלין, לאוצין, סרין, איזולאוצין או תראונין), וחומצת אמינו נוספת שניתן להפחית (בדרך כלל גליצין, פרולין או חומצה אספרטית ראו טבלה 1 ) [8, 9].

תגובת סטיקלנד. בסוג קלוסטרידיום, תסיסה של חומצות אמינו דורשת שני שלבים. (א) דימינציה חמצונית של חומצת האמינו עם מצב החמצון הגבוה יותר מניבה αחומצת קטו, אמוניום ושני פרוטונים. לדוגמה, אם R1 היא קבוצת מתיל (-CH3), אז חומצת האמינו התורמת היא אלאנין, והתוצר של הדימינציה החמצונית יהיה פירובט, תרכובות מרכזיות של חילוף החומרים המתווך. (ב) פוספט אנאורגני מתחבר לקצה הקרבוקסילי. הפרוטון השני תופס את מקומו של הרדיקל האמינו. התוצר של תגובה זו הוא אציל-פוספט. למשל כאשר R2 הוא מימן (ולכן חומצת האמינו המקבלת היא גליצין) מוצר זה מתאים לאצטיל-פוספט. שתי תרכובות הפוספט מ- A ו- B הן מצעים לסינתזה של ATP מ- ADP. באופן טבעי, ב Clostridium spp. כל התגובות הללו מתרחשות בעזרת hydrogenases (עבור תורמי האלקטרונים) ו- reductases (עבור מקבלי האלקטרונים). סינתזת ATP מזרזת על ידי קינאזות. עם זאת, במערכות כימו-אוטוטרופיות, האצטיל-פוספט הוא בקלות נושא האנרגיה (ראה טקסט).

שנית, חומצות אמינו מיוצרות בקלות בתרחישים פוטנציאליים רבים לסינתזה האביוטית של אבני הבניין של החיים. ניסוי מילר המפורסם [10] וסינתזים אחרים של מילר-אורי [11–13] משתמשים במקורות אנרגיה ליצירת חומצות אמינו מגזים. התיאוריה הכימית-אוטוטרופית "ברזל-גופרית" [14], התואמת את התנאים של פתחי אוורור הידרותרמיים מעושנים שחורים (חמים במיוחד וחומציים מאוד), מעסיקה את הכוח הרדוקטיבי של סולפידים וטמפרטורות גבוהות כדי לסנתז מולקולות אורגניות, כולל אמינו חומצות, דרך אסטרים תיאו. בפתחי האוורור החמים אך הבסיסיים (המעשנים הלבנים) הפחתה דומה של CO2 מתרחשת על ידי סולפידים, והתגובות המתרחשות מקבילות למסלול האצטוגנזה (ווד-לונגדאהל), שבו ענפי קיבוע החנקן מובילים לחומצות אמינו, אשר, בתורן, משמשות גם כמקדמות לסינתזת נוקלאוטידים [15].

בשלושת התרחישים נוצרים כמה "זוגות סטיקלנד" בקלות. בפרט, "חומצות האמינו מילר" [10] בעלות התשואה הגבוהה ביותר (בעיקר אלאנין, גליצין, חומצה אספרטית ואלין איור 4) יכולות ליצור ארבעה זוגות סטיקלנד: אלאנין+גליצין, אלאנין+חומצה אספרטית, ואלין+גליצין ואלין+ חומצה אספרטית. באופן דומה, בעולם הגופרית ברזל, גליצין, סרין וחומצה אספרטית מסונתזים בקלות [16], שם אנו מוצאים שגליצין+סרין וגליצין+חומצה אספרטית הם זוגות המגיבים לסטיקלנד. לבסוף, מלבד גליצין ואלנין, חומצות אספרטיות וגלוטמיות נוצרות גם בפתחי האוורטרם היתרותרמיים [15] היוצרים שוב את הזוגות אלנין+גליצין ואלנין+חומצה אספרטית וחומצה אספרטית+אלאנין.

התשואה של חומצות אמינו בניסוי מילר. התשואה נמדדת ב μמוצרי mol נובעים מ 336 ממול מתאן נוצץ, המתאימים לסך של 1.55%. נתונים מטבלה 1 מתוך [13]. הסורגים האפורים והלבנים מייצגים חומצות אמינו שהם תורמי אלקטרונים ומקבלים בתגובת סטיקלנד, בהתאמה. ציר התשואה הוא בקנה מידה לוגריתמי.

התצפית השלישית היא האנטי -קודונים המכריעים שמשלימים לעתים קרובות חומצות אמינו שחיברו זוגות סטיקלנד. הדבר נכון במיוחד לגבי חומצות האמינו "מילר" (שהן הפשוטות שבהן), וגם לגבי אנטיקודונים משלימים הכוללים זוגות G-U לא קנוניים. המתאם בין שתי צורות ההשלמה הללו (ההשלמה המטבולית או הסטיקלנד וההשלמה האנטי-קודונית) רלוונטי מכיוון שבאבולוציה של המתאמים הפרוטויים מילאה השלמת ה- RNA תפקיד בגיוון האנטי-קודונים [6, 17, 18].

שלוש עובדות עצמאיות אלה מצביעות על כך שתסיסה של חומצות אמינו הייתה יכולה למלא תפקיד ביצירת הקוד הגנטי. מטרת מאמר זה היא לפתח רעיון זה ביתר פירוט, לקבוע את ההשערה בצורה ניתנת לבדיקה ולנתח את ההשלכות שיש לה על ההבנה הנוכחית שלנו לגבי ההקשר של חילוף החומרים המוקדם ועל הגורמים שקבעו את התרגום. מְכוֹנוֹת.

אביוגנזה של חומצות אמינו

בשנות העשרים הציעו אופרין [19] והלדאן [20] כי בתנאים חמצניים ובמקורות אנרגיה מתאימים ייווצר באופן ספונטני חומר אורגני, שיהווה בסיס לצורות החיים הראשונות. מאוחר יותר, מילר [10] סינתז חומצות אמינו מתערובת של ארבעה גזים יסודיים: אמוניה (NH3), מתאן (CH4), מים (ח2O) ופחמן דו חמצני (CO2). תערובת זו יוצרת "אווירה רדוקטיבית", כלומר לתרכובות שנוצרות יש פוטנציאל משמעותי לעבור תגובות חמצון. חלק מהתרכובות הן תורמות אלקטרונים טובות, כגון אמוניה ומתאן. פחמן דו חמצני וחמצן מולקולרי הם מקבלי אלקטרונים רבי עוצמה. נוכחותם של מקבלי אלקטרונים היא קריטית לאורגניזמים, מכיוון שהם מאפשרים חמצון של מקורות פחמן (למשל גלוקוז) למים ופחמן דו חמצני, ושחרור נלווה של אנרגיה חופשית משמש לתהליכים מטבוליים חיוניים. עם זאת, ההבנה העכשווית מצביעה על כך שמתאן ואמוניה היו חסרים מהאטמוספירה ההדאית המוקדמת (לפני כ -4 מיליארד שנים). במקום זאת, חנקן מולקולרי (N.2) היה בשפע [21]. באווירת ה"מצמצמות חלשה "זו N.2 הוא תורם אלקטרונים גרוע, המגביל הן את המגוון והן את התשואה של התרכובות הניתנות להיווצרות אביוטית.

בכל מקרה, יישום אנרגיה לתערובות מפחיתות אלה מסנתז חומצות אמינו בעלות משמעות ביולוגית. זה נכון לכמה מהגרסאות של הניסוי של מילר [11]. ניסויים דמויי מילר בדרך כלל נותנים תשואות גבוהות יחסית של גליצין, חומצה אספרטית, אלאנין ואלין, בין היתר, בהתאם למקור האנרגיה ולתמהיל הראשוני [11–13, 22]. איור 4 מתאר את התשואות היחסיות של האטמוספירה המפחיתה, בהן מסונתזות בקלות כמה חומצות אמינו חשובות.

עם זאת ניתן להתווכח, באילו תנאים אטמוספריים אירע מקור הקוד הגנטי, ולכן היו חומצות האמינו שהיו רלוונטיות לחילוף חומרים מוקדם. אחת האפשרויות היא שהקוד הגנטי הוקם מיד לאחר מוצא החיים, בעולם שלפני ה- RNA במסגרת מרק פרה-ביוטי, באווירה מפחיתה חלשה עם תשואות נמוכות של גליצין, חומצה אספרטית ואלנין [11]. זוהי אפשרות לא סבירה מכיוון שחייבו להתקיים מטבוליזם אביוטי הכולל חומצות גרעין. גם התנאים הגיאולוגיים בתקופה זו היו קשים מאוד, שהתאפיינו בפעילות וולקנית עוינת וטמפרטורות גבוהות. תנאים אלה נחשבים שליליים מדי להקמת צורות חיים מוקדמות, אם כי לא ברור אם אכן היו יכולים להתקיים מטבוליזם אוטוטרופי. אפשרות נוספת היא שהקוד הגנטי הוקם בעולם ה- RNA המאוחר, לאחר שהאטמוספירה כבר השתנתה, אולי לכלול מתאן ואמוניה המופקים ממטבוליזם של פרוטוביונים מתאנוגניים. זה, כפי שאנו מבינים זאת, קרה בתקופה הארכאית, לפני כ -3.5 מיליארד שנים. זהו תרחיש סביר יותר מכיוון שבמטבוליזם שכבר קיים, קוד מתעורר נובע מארגון מחדש של תהליכים מבוססים. במילים אחרות, ההתאמות המוקדמות שנדרשו לצורך הקמת הקוד הגנטי תואמות את חילוף החומרים המוקדם.

Wächtershäuser סיכם והצביע על כמה סיבות לכך שה"מרק הפרביוטי "של מילר אינו פועל כמודל לאבולוציה פרה -ביוטית [14]. למרות שהסיבות הללו ניתנות לוויכוח, ראוי לשקול כי מרק פרה -ביוטי עשוי למעשה לא להיות התרחיש המתאים ביותר. טענה אחת חזקה היא שהרכב האטמוספירה הפרימיטיבית [21] לא יכלול את הגזים הדרושים לסינתזת חומצות אמינו קמאיות עם תשואה מספקת. כחלופה, הציע וכטרשאוזר את מה שכונה "הפיצה הפרימיטיבית" [1, עמ '32-33]. תיאוריה זו מציבה את התגובות הפרביוטיות המתרחשות לא בתמיסה, אלא על פני השטח של פיריט, מינרלים עשירים בברזל. קטיוני ברזל (טעונים חיוביים) ואניוני גופרית (טעונים שליליים) נספגים על פני השטח המינרליים ומגיבים ליצירת פיריט. תגובה זו, כלומר Fe 2+ + 2H2S → FeS2 + 4H + + 2e -, משחרר שני אלקטרונים והוא אקסרגוני, מה שהופך את האנרגיה לזמינה לתגובות כימיות אחרות. בין המסלולים הכימיים האפשריים, תגובות המשטח יכולות ליצור חומצות אמינו. רוב חומצות האמינו עשויות להיווצר באופן עקרוני. עם זאת, חומצות האמינו הראשונות שייווצרו על משטחי פיריט, ואשר בהשלכה מהוססת יהיו הראשונות להיכלל בקוד גנטי עתיק, יהיו סרין וחומצה אספרטית. הסרין ייבלע מיד לייצור גליצין [14]. בסינתזים ניסיוניים של התיאוריה של וכטרשאוזר, למעשה התקבלו כמה חומצות אמינו: גליצין, אלאנין וסרין [16], ואלנין, חומצה גלוטמית, פנילאלנין וטירוזין [23, 24].

תרחיש כימו-אוטוטרופי נוסף שכדאי לדון בו מתרחש למעשה בפתחי האוורור היתרותרמיים הבסיסיים [15]. ניתן לטעון כי הגדרה זו כוללת את התפיסה המקיפה ביותר של מקור מטבוליזם האנרגיה. גיאוסינתזה בכוחות קרום כדור הארץ שרפנות: סיליקטים של מגנזיום וברזל מתחמצנים על ידי מים ומייצרים H2. מימן מולקולרי זה משתחרר מאוחר יותר בפתחי האוורור ההידרותרמיים, שם הוא מגיב עם CO2 וגופרית ברזל (FeS), היוצרים אסטרים תיאו. תרכובות אלו מהוות את הבסיס לסינתזה של תרכובות וקופקטורים רבים, והן גם מקשרות הפעלה של אצטט עם פוספט כדי לתת אצטיל-פוספט, שאפשר לבצע הידרוליזה נוספת ולהסתיים באצטט (CH3COOH). כמו בתרחיש הברזל-גופרית, FeS יכול גם לזרז את האמינציה החמצונית של αחומצות קטו, וכתוצאה מכך אלנין, גליצין וחומצות אספרטיות וגלוטמיות. יש לציין כי ניתן ליצור פורינים ופירימידינים גם מחומצה אספרטית וגליצין (מסלול הכולל אסיל-פוספטים) [25].

לסיכום, תרחישים שונים אלה מספקים מסגרות קונטקסטואליות התומכות בסינתזה של חומצות אמינו. שאלת ייצור חומצת האמינו התשואה עדיין עומדת גם אם התיאוריות הללו חושפות מסלולים סבירים דה נובו סינתזה של חומצת אמינו, הערכות ניסיוניות הראו שהתשואה גרועה למדי בהשוואה לדרישות של אורגניזמים מודרניים. אך האם התשואה האביוטית הנמוכה יחסית של חומצות אמינו מספיקה כדי לקיים פרוטוביונים המבוססים על מטבוליזם של RNA? התשובה לשאלה זו תלויה במידה רבה בתפקידן של חומצות אמינו ברגע בו נקבע הקוד הגנטי.

תגובת סטיקלנד

תפקידן של חומצות האמינו קשור בהכרח לאופיין המבני והקטליטי של החלבונים. בהתחשב בגודלן הקטן, יהיה זה אבסורד לחשוב שלחומצות אמינו חופשיות יכול להיות תפקיד מבני. אך בגלל תכונותיהם הפיסיקליות-כימיות, חומצות אמינו חופשיות הקשורות ל- adapters RNA יכולות לסייע בקטליזה [7]. תיאוריית הידיות הקואנזימטיות המקודדות (CCH) טוענת שחומצות האמינו היו מחוברות קוולנטית לטרינוקלאוטידים, באופן שמזכיר קופקטורים מטבוליים, כגון ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד (NADH) או ATP למשל [7, 26]. הטרינוקלאוטידים שימשו כ"ידיות "דרכן ריבוזימים מחוברים באופן לא קוולנטי לחומצות האמינו. בדרך זו ניתן יהיה להשתמש מחדש בחומצות האמינו כדי לסייע בקטליזה [27]. כל קשר חד משמעי בין שלישיות לרפרטואר חומצות האמינו יבטיח כי ישמשו גורמים קטליטיים נכונים לתפקודים ספציפיים. זה מניח שכבר היה זמין רפרטואר מגוון של חומצות אמינו. הסינתזה של רוב חומצות האמינו החשובות ביותר מבחינה קטליטי היא מאוד משוכללת, והתשואה האביוטית שלהן זניחה (למעט חומצה אספרטית), עובדה שדוחה בהכרח את הפונקציות הקטליטיות של חומצות האמינו לשלבים היסטוריים מאוחרים יותר.

תפקיד בסיסי נוסף של מטבוליזם של חלבון וחומצות אמינו הוא תזונה.חומצות אמינו מתחמצנות באמצעות מחזור חומצת הלימון והופכות לאוריאה (הנפטרת) ולפירובאט וחומצות קטו אחרות ממחזור חומצת הלימון המשמשות בסינתזה אנבולית של תרכובות אחרות. לחומצות אמינו יש מצב חמצון דומה לזה של גלוקוז, דבר המצביע על כך שהן יכולות לעבור תסיסה, ובאורגניזמים קיימים התמוטטותן מעודדת סינתזת ATP.

ישנם מספר מסלולים קטבוליים של פירוק חומצת אמינו. בין אלה, תגובת הסטיקלנד היא היעילה ביותר, על ידי צירוף חמצון של חומצת אמינו אחת עם הפחתה של חומצה אחרת. חומצות האמינו המתחמצנות עוברות דימינציה על ידי חומצת האמינו dehydrogenases, ומאבדות בנוסף שני אלקטרונים ושני פרוטונים [28-30], וחומצת הקטו המתקבלת מאבדת פחמן אחד ל- CO2, ומוביל לסינתזת ATP על ידי זרחון ברמת המצע (איור 3 א) [9, 29–31]. לאחר מכן מצמידים תגובה זו ל"ענף הרדוקטיבי "על ידי העברת האלקטרונים והפרוטונים לחומצת האמינו האחרת, שעוברת דימינציה רדוקטיבית, המזרזת על ידי רדוקטאז [32-35]. לחומצת הקטו המופחתת יש אותו מספר פחמנים כמו חומצת האמינו המקבלת. בדרך כלל, הענף הרדוקטיבי אינו מוביל ל- ATP (אלא אם כן שני המצעים הם גליצין), (איור 3 ב) [36].

כמות האנרגיה החופשית הכוללת משתנה בהתאם לצמד חומצות האמינו הספציפיות שעוברות תסיסה, ולסטואיכיומטריה של התגובה. לדוגמה, תסיסה של ארבע שומות גליצין מובילה ל -3 שומות של תסיסת גליצין ואלנין מ- ATP (ביחס סטוכיומטרי של 3: 1 שומות) מובילה ל- 1.7 שומות ATP. שניהם מביאים לתשואה נמוכה יותר מהתסיסה של שני שומות גלוקוז, מה שמוביל ל -5 שומות ATP, אך עדיין יעיל בהשוואה לתשואה של תסיסה של פחמימות אחרות (למשל 3 שומות לקטט נותנות תשואה של 2.3 שומות ATP) [ [36, 37], צ'. 12].

התשואה האנרגטית מספיקה למעשה כדי לקיים אורגניזמים שמשתמשים אך ורק בחומצות אמינו כמקורות אנרגיה. הדוגמה המשכנעת ביותר היא הסוג קלוסטרידיום הכולל חיידקים כימאו -אוטוטרופיים, אנאירוביים [38]. מינים שונים עשויים או חייבים להשתמש בחומצות אמינו כמקור פחמן [9, 30, 35, 39, 40]. אולם הסוג קלוסטרידיום אינה קבוצה מונופילטית [40, 41], המצביעה על כך שלתגובת סטיקלנד יתכן שמקורו העצמאי (אפשרות בלתי סבירה בגלל הדמיון ברצף של הדהידרוגנטים והרדוקטזים [32]), אבדה בסוגים אחרים או נרכשה על ידי העברה לרוחב. בין המינים אנו מוצאים תרמופילית ואלקליפית, שחלקם קשורים לאוורור הידרותרמי [37, 38, 40, 42, 43]. זה כמעט ולא ממקם את מסלולי התגובה הקיימים של סטיקלנד בענף אבותי עמוק של עץ החיים, אך ניתן להעלות על הדעת כי גרסאות מקבילות, אם לא אבות, של מסלולי התגובה של סטיקלנד לא היו קיימים רק לפני הקמת הקוד, אלא יכלו גם לשחק תפקיד בהקמת הקוד, לפני יישום התפקיד הקטליטי והתרגום התפתח.

אבולוציה של המתאמים

בעיית השימוש בחומצות אמינו היא רק צד אחד של המטבע. הצד השני הוא כיצד חומצות אמינו הוקצו לשלישי קידוד. גם אם תפקידן של חומצות אמינו היה מובן מאליו, כמו ב- CCH או בתסיסת סטיקלנד, נותרה השאלה אילו גורמים קבעו משימות כאלה. בכל מקרה ניתן להניח שבשלב כלשהו ההקצאה כללה קשר קוולנטי בין חומצת האמינו למתאמי הפרוטו. נערך ויכוח האם הידיות הורכבו קודונים עתיקים או אנטיקודונים [5, 26], אך אסוציאציות סטריאוכימיות תומכות ברעיון שמדובר באנטי -קודונים [5, 6]. ידיות קואנזימטיות אלה התארכו מאוחר יותר ליצירת מיני סלילים. מבנים סליליים היו יכולים להעניק יציבות מבנית למתאמי הפרוטו (מבשרי tRNA), אולי לתפקוד קידוד. הרעיונות המוצגים במאמר זה מניחים שלב מיני-סלילי עבור מתאמי הפרוטו. סלילי המיני התפתחו בסופו של דבר על ידי כפילויות רצופות ורקורסיביות ליצירת המתאמים המודרניים עם מבנה העלה תלתן שלהם, tRNAs (איור 2, [6]). רעיון זה מבוסס במנגנון שהוצע לאחרונה. הוא טוען כי האב למתאמים היה גן פלינדרום קדמי המורכב מ -11 נוקלאוטידים. סיכת ראש קטנה זו תורכב משני רצפי בלוקים: שלישיית קידוד (ה- CCH, נניח, GCC) ותגי שכפול (משהו כמו רצף מקדם) עם רצף 5'-DCCA-3 '(כאשר D הוא A או U). אם השלישייה המקודדת מקושרת בין התג לרצף המשלים של התג, נוצר סיכת שיער קטנה של 11 נוקלאוטידים: UGGDGCCdCCA (כאשר d מציין את ההשלמה של D). כעת, תג פלוס שלישיה (7 נוקלאוטידים) משלים את גוש 11 הנוקלאוטידים, וניתן לקשור אותו באחד מקצותיו וליצור סיכת שיער של 18 נוקלאוטידים. אם דפוס זה חוזר על עצמו, ניתן לבנות את המולקולה הארוכה של נוקלאוטידים 76, ה- tRNA [6]. יש לציין, בכל איטרציה של מנגנון הכפלה-התארכות זה מתפתחות שתי מולקולות מתאם פרוטו (אחת בכל גדיל), התומכת בהשערה ארוכת השנים שחומצות אמינו נכללו בקוד בזוגות [6, 18, 44 –47].

מכיוון שלסיכת שיער יש רצף משלים בשני הגדילים, אז זוג מתאמי פרוטו עם אנטיקודונים משלימים משלימים באופן מלא. יתר על כן, סליל כפול RNA זה בוודאי היה פלינדרום (ראה איור 5). מה שמדהים הוא שזוגות tRNA מודרניים עם אנטיקודונים משלימים משלימים גם את רצפי קובעי חומצת האמינו בגזע [6, 18, 45, 46]. זה מצביע על כך שהרצפים בגבעול היו בוודאי תואמים את מבשריו של אנטיקודון. מתאם זה חזק יותר כאשר הזוג הלא קנוני G-U מותר בסלילים [45, 48, 49]. המשמעות, כמפורט להלן, היא שניתן להסביר את יתירותו של הקוד במונחים של ההתפתחות השיתופית של מבשרי האנטי -קודון [18, 45, 46]. ראשית, ההנחה היא כי מתאמי פרוטו עם אנטיקודונים משלימים בעת שכפול יוצרים סלילים כפולים תקשורתיים. משכפלים של RNA באיכות נמוכה הפיקו אנטיקודונים בלתי מוקצים, אולי על ידי מוטציות, אך בעיקר על ידי שימוש בזיווג G-U [6]. שנית, קודונים לא מוקצים אלה הוקצו לחומצות אמינו חדשות בעוד שתוספותיהם, בדומה למתאם הפרוטו המקורי, הוקצו לחומצות האמינו המקוריות [18, 45]. שקול למשל GCC, אנטיקודון המוקצה לגליצין. קודון זה יכול לייצר שלישייה שהוקצתה בתחילה על ידי שכפול תבניות: GGU. האחרון, באמצעות התאמה נכונה של ווטסון-קריק, מייצר ACC, שהוא עוד אנטיקודון לגליצין. לאחר מכן הוקצה ה- GGU האנטי -קודוני ביניים לחומצת אמינו חדשה (במקרה זה, תראונין). ניתן להרחיב את המנגנון הזה לאנטי -קודונים אחרים, ולהסביר באופן שיגרתי את שילובם של כמה חומצות אמינו בזוגות, אם כי הוא אינו מסביר מדוע זוגות ספציפיים (נניח, גליצין וטראונין) הוקצו לצמד האנטי -קודונים ACC ו- GGU.

הגן הפלינדרום הקדמי. שני מיני סלילים בעלי אנטיקודונים משלימים אך זהים אחרת, יכולים להתפתח ולהתעמעם ליצירת סליל כפול RNA. סליל כפול זה הוא פלינדרום.


תוכן

בדרך כלל ה- DNA אינו קיים כחוט אחד, אלא כזוג גדילים המחוברים זה לזה. [9] [12] שני גדילים ארוכים אלה מתפתלים זה סביב זה, בצורת סליל כפול. הנוקלאוטיד מכיל גם קטע של עמוד השדרה של המולקולה (שמחזיק את השרשרת יחד) וגם נוקלאובאז (שמתקשר עם גדיל ה- DNA השני בסליל). נוקלאובאז המקושר לסוכר נקרא נוקלאוזיד, ובסיס המקושר לסוכר ולקבוצת פוספט אחת או יותר נקרא נוקלאוטיד. ביופולימר הכולל נוקלאוטידים מקושרים מרובים (כמו ב- DNA) נקרא פולינוקלאוטיד. [13]

עמוד השדרה של גדיל ה- DNA עשוי מקבוצות פוספט וסוכר מתחלפות. [14] הסוכר ב- DNA הוא 2-deoxyribose, שהוא סוכר פנטוז (חמישה פחמן). הסוכרים מחוברים יחד על ידי קבוצות פוספט שיוצרות קשרי פוספודיאסטר בין אטומי הפחמן השלישי והחמישי של טבעות הסוכר הסמוכות. אלה ידועים בשם פחמן 3'-קצה (שלושה קצה ראשוני) ו -5 '(חמש קצה), וסמל הפריים משמש להבחין באטומי הפחמן הללו מאלו של הבסיס שאליו יוצר הדאוקסיריבוז קשר גליקוזידי. . לכן, לכל גדיל DNA יש בדרך כלל קצה אחד שבו יש קבוצת פוספט המחוברת לפחמן 5 ′ של ריבוז (הפוספוריל 5 ′) וקצה אחר בו יש קבוצת הידרוקסיל חופשית המחוברת לפחמן 3 ′ של a ריבוז (הידרוקסיל 3 ′). הכיוון של הפחמנים 3 'ו- 5' לאורך עמוד השדרה של סוכר-פוספט מקנה כיווניות (המכונה לפעמים קוטביות) לכל גדיל DNA. בסליל כפול של חומצת גרעין, כיוון הנוקלאוטידים בחוט אחד מנוגד לכיוון שלהם בחוט השני: החוטים הם אנטי -מקבילים. לקצוות האסימטריים של גדילים DNA יש כיוון של חמישה קצה ראשוני (5 ') ושלושה קצה ראשוני (3'), כאשר לקצה 5 'יש קבוצת פוספט סופנית וקצה 3' קבוצה של הידרוקסיל סופי. הבדל עיקרי אחד בין DNA ל- RNA הוא הסוכר, כאשר ה- 2-deoxyribose בדנ"א מוחלף בריבוז הסוכר הפנטוז החלופי ב- RNA. [12]

סיווג Nucleobase

בסיסים לא קנוניים

בסיסים משתנים מתרחשים ב- DNA. הראשון מבין אלה שהוכר היה 5-מתילציטוזין, שנמצא בגנום של שחפת Mycobacterium בשנת 1925. [20] הסיבה להימצאותם של בסיסים לא קנוניים אלה בנגיפים חיידקיים (בקטריופאגים) היא הימנעות מאנזימי ההגבלה הקיימים בחיידקים. מערכת אנזים זו פועלת לפחות בחלקה כמערכת חיסונית מולקולרית המגנה על חיידקים מפני הידבקות על ידי וירוסים. [21] שינויים בבסיסי ציטוזין ואדנין, בסיסי ה- DNA הנפוצים והמשתנים יותר, ממלאים תפקידים חיוניים בשליטה האפיגנטית על ביטוי הגנים בצמחים ובעלי חיים. [22]

רישום של בסיסים לא קנוניים המצויים ב- DNA

ידוע כי מספר בסיסים לא קנוניים מתרחשים ב- DNA. [23] רוב אלה הם שינויים בבסיסים הקנוניים בתוספת אורציל.

  • שונה אדנוזין
    • N6-carbamoyl-methyladenine
    • N6-מתיאדינין
    • 7-דיאזגואנין
    • 7-מתילגואנין
    • N4-מתילציטוזין
    • 5-קרבוקסילציטוזין
    • 5-פורמילציטוזין
    • 5-גליקוזיל-הידרוקסימתילציטוזין
    • 5-הידרוקסיציטוזין
    • 5-מתילציטוזין
    • α-Glutamythymidine
    • α-Putrescinylthymine
    • בסיס י
    • Uracil
    • 5-דיהידרוקסיפנטאורציל
    • 5-Hydroxymethyldeoxyuracil
    • Deoxyarchaeosine
    • 2,6-דימינופורין (2-אמינאדנין)

    חריצים

    גדילים סליליים תאומים יוצרים את עמוד השדרה של ה- DNA. ניתן למצוא סליל כפול נוסף המתחקה אחר הרווחים, או החריצים, בין הגדילים. חללים אלה צמודים לזוגות הבסיס ועשויים לספק אתר מחייב. מכיוון שהחוטים אינם ממוקמים סימטרית ביחס אחד לשני, החריצים בגודל לא שווה. החריץ האחד, החריץ העיקרי, רחב 22 אונגסטרומים (2.2 ננומטר) והשני, החריץ הקטין, רחב 12 Å (1.2 ננומטר). [24] רוחב החריץ הראשי פירושו שקצוות הבסיסים נגישים יותר בחריץ הראשי מאשר בחריץ הקטין. כתוצאה מכך, חלבונים כגון גורמי שעתוק שיכולים להיקשר לרצפים ספציפיים ב- DNA דו-גדילי יוצרים בדרך כלל מגע עם צידי הבסיסים החשופים בחריץ העיקרי. [25] מצב זה משתנה בהתאמות יוצאות דופן של ה- DNA בתוך התא (ראה למטה), אבל החריצים הגדולים והקטנים נקראים תמיד על מנת לשקף את ההבדלים בגודל שייראו אם ה- DNA יתעוות בחזרה לצורת B הרגילה.

    זיווג בסיס

    SsDNA לעומת dsDNA

    במעבדה ניתן למדוד את עוצמת האינטראקציה הזו על ידי מציאת הטמפרטורה הדרושה לשבירת מחצית מקשרי המימן, טמפרטורת ההיתוך שלהם (הנקראת גם טM ערך). כאשר כל זוגות הבסיס בתוך סליל כפול DNA נמסים, הגדילים נפרדים וקיימים בתמיסה כשתי מולקולות עצמאיות לחלוטין. למולקולות ה- DNA החד-גדיליות הללו אין צורה משותפת אחת, אך כמה קונפורמציות יציבות יותר מאחרות. [30]

    חוש ואנטי -חוש

    רצף DNA נקרא רצף "חוש" אם הוא זהה לזה של העתק RNA שליח שמתורגם לחלבון. [31] הרצף על הגדיל הנגדי נקרא רצף "אנטיסנס". שני רצפים חושיים ואנטי -חושיים יכולים להתקיים בחלקים שונים של אותו קווצת DNA (כלומר, שני הגדילים יכולים להכיל רצפים של חוש וחוש). הן בפרוקריוטים והן באיקריוטים, נוצרים רצפי RNA אנטי -חושים, אך הפונקציות של RNA אלה אינן ברורות לחלוטין. [32] הצעה אחת היא כי RNAs אנטי-חושים מעורבים בוויסות ביטוי הגנים באמצעות זיווג בסיס RNA-RNA. [33]

    כמה רצפי DNA בפרוקריוטים ואאוקריוטים, ועוד בפלסמידים ווירוסים, מטשטשים את ההבחנה בין חוטים לחושי אנטי -חושים על ידי גנים חופפים. [34] במקרים אלה, חלק מרצפי ה- DNA מבצעים חובה כפולה, המקודדים חלבון אחד בעת קריאתו לאורך גדיל אחד, וחלבון שני בעת קריאה בכיוון ההפוך לאורך הגדיל השני. בחיידקים, חפיפה זו עשויה להיות מעורבת בוויסות שעתוק הגנים, [35] בעוד שבוירוסים גנים חופפים מגדילים את כמות המידע שניתן לקודד בתוך הגנום הנגיפי הקטן. [36]

    סליל -על

    DNA יכול להתפתל כמו חבל בתהליך שנקרא DNA supercoiling. כאשר ה- DNA במצב "רגוע" שלו, גדיל בדרך כלל מקיף את ציר הסליל הכפול פעם ב -10.4 זוגות בסיס, אך אם ה- DNA מעוות החוטים הופכים לפצעים הדוקים יותר או רופפים יותר. [37] אם ה- DNA מעוות לכיוון הסליל, זהו סליל -על חיובי, והבסיסים מוחזקים חזק יותר יחד. אם הם מעוותים בכיוון ההפוך, זהו סליל -על שלילי, והבסיסים מתפרקים ביתר קלות. בטבע, ברוב ה- DNA יש סליל -על שלילי קל שמוצג על ידי אנזימים הנקראים טופואיזומראז. [38] אנזימים אלה נחוצים גם כדי להקל על הלחצים המתפתלים המוכנסים לגדילי DNA במהלך תהליכים כגון שעתוק ושכפול DNA. [39]

    מבני DNA חלופיים

    DNA קיים בהרבה קונפורמציות אפשריות הכוללות צורות A-DNA, B-DNA ו- Z-DNA, אם כי רק B-DNA ו- Z-DNA נצפו ישירות באורגניזמים פונקציונליים. [14] הקונפורמציה ש- DNA מאמץ תלויה ברמת ההידרציה, ברצף ה- DNA, בכמות וכיוון סליל -העל, בשינויים כימיים של הבסיסים, בסוג ובריכוז יוני המתכת ובהימצאות פוליאמינים בתמיסה. [40]

    הדיווחים הראשונים שפורסמו על דפוסי עקיפה של רנטגן A-DNA-וגם B-DNA-השתמשו בניתוחים המבוססים על טרנספורמציות של פטרסון שסיפקו רק כמות מוגבלת של מידע מבני עבור סיבי DNA מכוונים. [41] [42] לאחר מכן הציע וילקינס ניתוח חלופי ואח '., בשנת 1953, עבור in vivo תבניות פיזור עקיפה מסוג B-DNA של סיבי דנ"א עם לחות גבוהה מבחינת ריבועים של פונקציות בסל. [43] באותו כתב עת הציגו ג'יימס ווטסון ופרנסיס קריק את ניתוח הדוגמנות המולקולריות שלהם של דפוסי העקיפה של רנטגן של ה- DNA כדי להצביע על כך שהמבנה הוא סליל כפול. [9]

    למרות ש צורת B-DNA הוא הנפוץ ביותר בתנאים הנמצאים בתאים, [44] אין זו קונפורמציה מוגדרת היטב אלא משפחה של קונפורמציות DNA קשורות [45] המתרחשות ברמות הלחות הגבוהות הקיימות בתאים. הדפקטציה והפיזור הרנטגן המקבילים שלהם אופייניים לפאראקריסטלים מולקולריים בעלי דרגה ניכרת של הפרעה. [46] [47]

    בהשוואה ל- B-DNA, צורת ה- A-DNA היא ספירלה ימנית רחבה יותר, עם חריץ מינורי רדוד ורחב וחריץ גדול וצר יותר. צורת A מתרחשת בתנאים לא פיזיולוגיים בדגימות DNA מיובשות חלקית, בעוד שבתא היא עשויה להיות מיוצרת בזיווגים היברידיים של קווצות DNA ו- RNA, ובמתחמי אנזים- DNA. [48] ​​[49] קטעי DNA בהם הבסיסים שונו כימית על ידי מתילציה עשויים לעבור שינוי גדול יותר בקונפורמציה ולאמץ את צורת ה- Z. כאן, הגדילים מסתובבים על ציר הסליל בספירלה שמאלית, ההפך מצורת B הנפוצה יותר. [50] ניתן לזהות מבנים יוצאי דופן אלה על ידי חלבונים ספציפיים המחייבים Z-DNA ועשויים להיות מעורבים בוויסות התעתיק. [51]

    כימיה DNA אלטרנטיבית

    במשך שנים רבות הציעו אקסוביולוגים את קיומה של ביוספירה צללית, ביוספירה מיקרוביאלית של כדור הארץ, שמשתמשת בתהליכים ביוכימיים ומולקולריים שונים בתכלית מאשר החיים המוכרים כיום. אחת ההצעות הייתה קיומם של צורות חיים המשתמשות בארסן במקום בזרחן ב- DNA. פורסם דיווח בשנת 2010 על האפשרות בחיידק GFAJ-1, [52] [53] למרות שהמחלוקת שנויה במחלוקת, [53] [54] והעדויות מצביעות על כך שהחיידק מונע באופן פעיל שילוב של ארסן בעמוד השדרה של ה- DNA. וביומולקולות אחרות. [55]

    מבנים מרובעים

    בקצות הכרומוזומים הליניאריים נמצאים אזורים מיוחדים של DNA הנקראים טלומרים. התפקיד העיקרי של אזורים אלה הוא לאפשר לתא לשכפל את קצות הכרומוזומים באמצעות האנזים טלומראז, מכיוון שהאנזימים שבדרך כלל משכפלים DNA אינם יכולים להעתיק את קצוות 3 'הקיצוניים של הכרומוזומים. [56] כובעי כרומוזומים מיוחדים אלה מסייעים גם בהגנה על קצות ה- DNA, ומונעים ממערכות תיקון ה- DNA בתא להתייחס אליהן כאל נזק שיש לתקן. [57] בתאים אנושיים, טלומרים הם בדרך כלל אורכים של DNA חד גדילי המכיל כמה אלפי חזרות של רצף TTAGGG פשוט. [58]

    רצפים אלה עשירים בגואנין עשויים לייצב את קצות הכרומוזומים על ידי יצירת מבנים של קבוצות מוערמות של יחידות בעלות ארבע בסיסים, ולא זוגות הבסיס הרגילים המצויים במולקולות DNA אחרות. כאן, ארבעה בסיסי גואנין, המכונים טטראד גואנין, יוצרים צלחת שטוחה. יחידות שטוחות אלה בעלות ארבעה בסיס ואז נערמות זו על גבי זו ליצירת מבנה יציב G-quadruplex. [60] מבנים אלה מיוצבים על ידי חיבור מימן בין קצוות הבסיסים וקילציה של יון מתכת במרכז כל יחידת ארבעה בסיסים. [61] ניתן ליצור גם מבנים אחרים, כאשר המערך המרכזי של ארבעה בסיסים מגיע מחוט אחד מקופל סביב הבסיסים, או מכמה גדילים מקבילים שונים, שכל אחד מהם תורם בסיס אחד למבנה המרכזי.

    בנוסף למבנים מוערמים אלה, הטלומרים יוצרים גם מבני לולאה גדולים הנקראים לולאות טלומרים, או לולאות T. כאן, ה- DNA החד גדילי מתפתל במעגל ארוך שהתייצב על ידי חלבונים מחייבי טלומרים. [62] ממש בקצה לולאת ה- T, ה- DNA החד-גדי של הטלומרים מוחזק על אזור של DNA דו-גדילי על ידי גדיל הטלומרים המשבש את ה- DNA הסליל הכפול ואת זיווג הבסיס לאחת משתי הגדילים. מבנה משולש זה נקרא לולאת תזוזה או לולאת D. [60]

    DNA מסועף

    ב- DNA, התפרקות מתרחשת כאשר קיימים אזורים לא משלימים בקצה של גדיל כפול משלים של DNA.עם זאת, דנ"א מסועף יכול להתרחש אם מוצג גדיל שלישי של דנ"א ומכיל אזורים סמוכים המסוגלים להכלאה עם האזורים הקרועים של הגדיל הכפול הקיים. למרות שהדוגמה הפשוטה ביותר ל- DNA מסועף כוללת רק שלושה גדילים של DNA, אפשר גם מתחמים הכוללים גדילים נוספים וענפים מרובים. [63] ניתן להשתמש ב- DNA מסועף בננוטכנולוגיה לבניית צורות גיאומטריות, ראו פרק שימושים בטכנולוגיה להלן.

    בסיסים מלאכותיים

    מספר נוקלאובאזים מלאכותיים סונתזו, ושולבו בהצלחה באנלוגי ה- DNA בעל שמונה הבסיסים בשם Hachimoji DNA. בסיסים מלאכותיים אלה, המכונים S, B, P ו- Z, מסוגלים להיקשר זה לזה בצורה צפויה (S – B ו- P – Z), לשמור על מבנה הסליל הכפול של ה- DNA ולהיות מועתק ל- RNA. אפשר לראות בקיומם אינדיקציה לכך שאין שום דבר מיוחד בארבעת הנוקלאובאזים הטבעיים שהתפתחו על כדור הארץ. [64] [65] מאידך גיסא, ה- DNA קשור קשר הדוק ל- RNA אשר לא רק פועל כתמלול של DNA אלא גם מבצע כמכונות מולולריות משימות רבות בתאים. לשם כך עליו להתקפל למבנה. הוכח כי כדי לאפשר את יצירת כל המבנים האפשריים נדרשים לפחות ארבעה בסיסים עבור ה- RNA המקביל, [66] בעוד שגם מספר גבוה יותר אפשרי אך זה יהיה בניגוד לעקרון הטבעי של המאמץ הקטן ביותר.

    שינויי בסיס ואריזת DNA

    ביטוי הגנים מושפע מהאופן שבו ה- DNA ארוז בכרומוזומים, במבנה הנקרא כרומטין. שינויים בבסיס יכולים להיות מעורבים באריזה, עם אזורים בעלי ביטוי גנטי נמוך או ללא בדרך כלל המכילים בדרך כלל רמות גבוהות של מתילציה של בסיסי ציטוזין. אריזת DNA והשפעתה על ביטוי הגנים יכולים להתרחש גם על ידי שינויים קוולנטיים של ליבת חלבון ההיסטון שסביבו DNA עטוף במבנה הכרומטין או אחרת על ידי שיפוץ המתבצע על ידי מתחמי שיפוץ הכרומטין (ראה שיפוץ כרומטין). קיים גם דיון בין מתילציה של DNA לשינוי היסטון, כך שהם יכולים להשפיע באופן קואורדינטיבי על הכרומטין ועל ביטוי הגנים. [67]

    לדוגמא אחת, מתילציה של ציטוזין מייצרת 5-מתילציטוזין, שהיא חשובה לחיסול X של הכרומוזומים. [68] רמת המתילציה הממוצעת משתנה בין אורגניזמים - התולעת Caenorhabditis elegans חסר מתילציה של ציטוזין, בעוד שחולייתנים בעלי רמות גבוהות יותר, כאשר עד 1% מה- DNA שלהם מכיל 5-מתילציטוזין. [69] למרות חשיבותו של 5-מתילציטוזין, הוא יכול להתעורר לעזוב בסיס תימין, ולכן ציטוזינים מתילטים מועדים במיוחד למוטציות. [70] שינויים בסיסיים אחרים כוללים מתילציה של אדנין בחיידקים, נוכחות של 5-הידרוקסימתילציטוזין במוח, [71] וגליקוזילציה של אורציל לייצור ה- "J-base" בקינטופלסטים. [72] [73]

    נֵזֶק

    ה- DNA יכול להיפגע ממגוון סוגים של מוטגנים, המשנים את רצף ה- DNA. המוטגנים כוללים סוכני חמצון, סוכני אלקילציה וגם קרינה אלקטרומגנטית באנרגיה גבוהה כגון אור אולטרה סגול וקרני רנטגן. סוג הנזק שנגרם ל- DNA תלוי בסוג המוטגן. לדוגמה, אור UV יכול לפגוע ב- DNA על ידי ייצור דימרים של תימין, שהם קישורים צולבים בין בסיסי פירימידין. [75] מאידך גיסא, חמצנים כגון רדיקלים חופשיים או מי חמצן מייצרים נזקים מרובים, כולל שינויים בבסיס, במיוחד של גואנוזין, ושבירות של גדילים כפולים. [76] תא אנושי טיפוסי מכיל כ -150,000 בסיסים שסבלו מנזק חמצוני. [77] מבין הנגעים החמצוניים הללו, המסוכנים ביותר הם שבירות של גדילים כפולים, מכיוון שקשה לתקן אותן ויכולות לייצר מוטציות נקודתיות, הוספות, מחיקות מרצף ה- DNA והעברות כרומוזומליות. [78] מוטציות אלו עלולות לגרום לסרטן. בגלל המגבלות הטבועות במנגנוני תיקון ה- DNA, אם בני אדם היו חיים מספיק זמן, כולם היו בסופו של דבר מפתחים סרטן. [79] [80] נזקי DNA המתרחשים באופן טבעי, בשל תהליכים סלולריים תקינים המייצרים מיני חמצן תגובתי, הפעילות ההידרוליטית של מים סלולריים וכו ', מתרחשים גם הם בתדירות גבוהה. למרות שרוב הנזקים הללו מתוקנים, בכל תא עלול להישאר פגיעה כלשהי ב- DNA למרות הפעולה של תהליכי תיקון. נזקי ה- DNA הנותרים האלה מצטברים עם הגיל ברקמות פוסטמיטוטיות של יונקים. הצטברות זו נראית כגורם בסיסי חשוב להזדקנות. [81] [82] [83]

    מוטציות רבות נכנסות לחלל שבין שני זוגות בסיס סמוכים, זה נקרא אינטראקציה. רוב האינטרקלטורים הם מולקולות ארומטיות ומישוריות דוגמאות כוללות אתידיום ברומיד, אקרידינים, דאונומיצין ודוקסורוביצין. כדי שבין -מחולל יתאים בין זוגות הבסיס, הבסיסים חייבים להפריד, ולעוות את קווצות ה- DNA על ידי פירוק הסליל הכפול. זה מעכב הן שעתוק והן שכפול DNA, וגורם לרעילות ומוטציות. [84] כתוצאה מכך, אינטראקלטורים של DNA עשויים להיות מסרטנים, ובמקרה של תלידומיד, טרטוגן. [85] אחרים כגון בנזו [א] פיירן דיול אפוקסיד ואפלטוקסין יוצרים תוספי DNA המעוררים טעויות בשכפול. [86] למרות זאת, בשל יכולתם לעכב שעתוק ושכפול DNA, רעלים דומים אחרים משמשים גם בכימותרפיה כדי לעכב תאים סרטניים שצומחים במהירות. [87]

    בדרך כלל DNA מתרחש כרומוזומים ליניאריים באאוקריוטים, כרומוזומים מעגליים בפרוקריוטים. קבוצת הכרומוזומים בתא מהווה את הגנום שלה הגנום האנושי כולל כ -3 מיליארד זוגות בסיס של DNA המסודרים ל -46 כרומוזומים. [88] המידע שנושא ה- DNA מוחזק ברצף של פיסות DNA הנקראות גנים. העברת מידע גנטי בגנים מושגת באמצעות זיווג בסיס משלים. לדוגמה, בתעתיק, כאשר תא משתמש במידע בגן, רצף ה- DNA מועתק לרצף RNA משלים באמצעות המשיכה בין ה- DNA לבין נוקלאוטידים RNA הנכונים. בדרך כלל, עותק RNA זה משמש לאחר מכן ליצירת רצף חלבון תואם בתהליך הנקרא תרגום, התלוי באותה אינטראקציה בין נוקלאוטידים של RNA. באופן חלופי, תא עשוי פשוט להעתיק את המידע הגנטי שלו בתהליך שנקרא שכפול DNA. פרטי הפונקציות הללו מכוסים במאמרים אחרים כאן ההתמקדות היא באינטראקציות בין DNA לבין מולקולות אחרות המתווכות את תפקוד הגנום.

    גנים וגנום

    ה- DNA הגנומי ארוז היטב ומסודר בתהליך הנקרא עיבוי DNA, כך שיתאים לכמויות הזמינות הקטנות של התא. באיקריוטים DNA נמצא בגרעין התא, עם כמויות קטנות במיטוכונדריה ובכלורופלסטים. בפרוקריוטים, ה- DNA מוחזק בתוך גוף מעוצב בצורה לא סדירה בציטופלזמה הנקראת נוקלאואיד. [89] המידע הגנטי בגנום מוחזק בתוך גנים, והמערך המלא של מידע זה באורגניזם נקרא הגנוטיפ שלו. גן הוא יחידת תורשה והוא אזור של DNA המשפיע על מאפיין מסוים באורגניזם. הגנים מכילים מסגרת קריאה פתוחה הניתנת לתמלול ורצפים רגולטוריים כגון מקדמים ומשפרים, השולטים בתעתיק של מסגרת הקריאה הפתוחה.

    במינים רבים, רק חלק קטן מהרצף הכולל של הגנום מקודד לחלבון. לדוגמה, רק כ -1.5% מהגנום האנושי מורכב מאקסונים המקודדים חלבון, כאשר למעלה מ -50% מה- DNA האנושי מורכב מרצפים חוזרים ונשנים. [90] הסיבות לנוכחות כל כך הרבה DNA לא מקודד בגנום אוקריוטי וההבדלים יוצאי הדופן בגודל הגנום, או ערך C, בין המינים, מייצגים חידה ארוכת שנים המכונה "חידת ערך C". [91] עם זאת, כמה רצפי DNA שאינם מקודדים חלבון עשויים עדיין לקודד מולקולות RNA תפקודיות שאינן מקודדות, המעורבות בוויסות ביטוי הגנים. [92]

    כמה רצפי DNA שאינם מקודדים ממלאים תפקידים מבניים בכרומוזומים. הטלומרים והצנטרומרים מכילים בדרך כלל מעט גנים אך חשובים לתפקודם ויציבותם של הכרומוזומים. [57] [94] צורה שופעת של DNA לא מקודד בבני אדם הם פסאודוגנים, שהם עותקים של גנים שהושבתו על ידי מוטציה. [95] רצפים אלה הם בדרך כלל רק מאובנים מולקולריים, אם כי מדי פעם הם יכולים לשמש חומר גנטי גולמי ליצירת גנים חדשים באמצעות תהליך של שכפול גנים והתבדלות. [96]

    תמלול ותרגום

    גן הוא רצף של DNA המכיל מידע גנטי ויכול להשפיע על הפנוטיפ של אורגניזם. בתוך גן, רצף הבסיסים לאורך גדיל DNA מגדיר רצף RNA שליח, המגדיר לאחר מכן רצף חלבון אחד או יותר. הקשר בין רצפי הנוקלאוטיד של גנים לבין רצפי חומצות האמינו של החלבונים נקבע על פי כללי התרגום, המכונים ביחד את הקוד הגנטי. הקוד הגנטי מורכב מ'מילים 'של שלוש אותיות הנקראות קודונים נוצר מרצף של שלושה נוקלאוטידים (למשל ACT, CAG, TTT).

    בתעתיק, קודונים של גן מועתקים ל- RNA שליח על ידי פולימראז RNA. עותק RNA זה מפוענח לאחר מכן על ידי ריבוזום הקורא את רצף ה- RNA על ידי התאמת בסיס ה- RNA לשליח להעברת RNA, הנושא חומצות אמינו. מכיוון שיש 4 בסיסים בצירופי 3 אותיות, ישנם 64 קודונים אפשריים (4 3 שילובים). אלה מקודדים את עשרים חומצות האמינו הסטנדרטיות, ומעניקים לרוב חומצות האמינו יותר מקודון אפשרי אחד. ישנם גם שלושה קודונים 'עצור' או 'שטויות' המסמנים את סוף אזור הקידוד. אלה הם קודוני TAA, TGA ו- TAG.

    שכפול

    חלוקת תאים חיונית לאורגניזם לצמוח, אך כאשר תא מתחלק, עליו לשכפל את ה- DNA בגנום שלו כך שלשני תאי הבת יהיה אותו מידע גנטי כמו הוריהם. המבנה הדו-גדילי של ה- DNA מספק מנגנון פשוט לשכפול ה- DNA. כאן, שני הגדילים מופרדים ואז רצף ה- DNA המשלים של כל גדיל משוחזר על ידי אנזים הנקרא DNA פולימראז. אנזים זה הופך את הגדיל המשלים על ידי מציאת הבסיס הנכון באמצעות זיווג בסיס משלים והדבקתו על הגדיל המקורי. מכיוון שפולימראזות DNA יכולות להאריך רק גדיל DNA בכיוון 5 'עד 3', משתמשים במנגנונים שונים להעתיק את הגדילים האנטי -מקבילים של הסליל הכפול. [97] באופן זה, הבסיס על הגדיל הישן מכתיב איזה בסיס מופיע על הגדיל החדש, והתא מסתיים בהעתק מושלם של ה- DNA שלו.

    חומצות גרעין תאיים

    DNA חוץ -תאי עירום (eDNA), רובו משתחרר כתוצאה ממוות תאים, נמצא כמעט בכל מקום בסביבה. ריכוזו בקרקע עשוי להיות גבוה עד 2 מיקרוגרם/ליטר, וריכוזו בסביבות מים טבעיות עשוי להיות גבוה עד 88 מיקרוגרם/ליטר. [98] פונקציות אפשריות שונות הוצעו עבור eDNA: הוא עשוי להיות מעורב בהעברת גנים אופקית [99] הוא עשוי לספק חומרים מזינים [100] והוא עשוי לשמש כמאגר לגיוס או טיטרציה של יונים או אנטיביוטיקה. [101] DNA חוץ -תאי פועל כמרכיב מטריקס חוץ -תאי פונקציונלי בביופילמים של מספר מיני חיידקים. הוא עשוי לשמש גורם זיהוי להסדרת ההתקשרות והפיזור של סוגי תאים ספציפיים בביופילם [102] הוא עשוי לתרום להיווצרות ביופילם [103] והוא עשוי לתרום לחוסנו הפיזי של הביופילם ולהתנגדותו ללחץ ביולוגי. [104]

    דנ"א עוברי ללא תאים נמצא בדם של האם, וניתן לרצף אותו כדי לקבוע מידע רב על העובר המתפתח. [105]

    תחת השם DNA סביבתי eDNA ראה שימוש מוגבר במדעי הטבע ככלי סקר לאקולוגיה, מעקב אחר תנועות והימצאות מינים במים, באוויר או ביבשה, והערכת המגוון הביולוגי של האזור. [106] [107]

    כל תפקודי ה- DNA תלויים באינטראקציות עם חלבונים. אינטראקציות חלבון אלו יכולות להיות לא ספציפיות, או שהחלבון יכול להיקשר באופן ספציפי לרצף DNA יחיד. אנזימים יכולים גם להיקשר ל- DNA ומתוכם, הפולימראזות המעתיקות את רצף בסיס ה- DNA בשעתוק ושכפול ה- DNA חשובות במיוחד.

    חלבונים המחייבים DNA

    חלבונים מבניים הקושרים DNA הם דוגמאות מובנות היטב לאינטראקציות DNA-חלבון לא ספציפיות. בתוך הכרומוזומים, ה- DNA מוחזק במתחמים עם חלבונים מבניים. חלבונים אלה מארגנים את ה- DNA למבנה קומפקטי הנקרא כרומטין. באיקריוטים, מבנה זה כולל כריכת DNA לקומפלקס של חלבונים בסיסיים קטנים הנקראים היסטונים, בעוד שבפרוקריוטים מעורבים סוגים רבים של חלבונים. [108] [109] ההיסטונים יוצרים קומפלקס בצורת דיסק הנקרא נוקלאוזום, המכיל שתי סיבובים שלמים של DNA דו-גדילי עטוף סביב פני השטח שלו. אינטראקציות לא ספציפיות אלה נוצרות באמצעות שאריות בסיסיות בהיסטונים, מה שהופך קשרים יוניים לעמוד השדרה החומצי של הסוכר-פוספט של ה- DNA, ולכן הם בלתי תלויים במידה רבה ברצף הבסיס. [110] שינויים כימיים של שאריות חומצות אמינו בסיסיות אלה כוללות מתילציה, זרחון ואצטילציה. [111] שינויים כימיים אלה משנים את עוצמת האינטראקציה בין ה- DNA להיסטונים, מה שהופך את ה- DNA לנגיש פחות או יותר לגורמי שעתוק ומשנה את קצב התעתיק. [112] חלבונים לא ספציפיים אחרים המחייבים DNA בכרומטין כוללים את חלבוני קבוצת הניידות הגבוהה, הנקשרים ל- DNA כפוף או מעוות. [113] חלבונים אלה חשובים בכיפוף מערכים של נוקלאוזומים וסידורם למבנים הגדולים יותר המרכיבים כרומוזומים. [114]

    קבוצה מובחנת של חלבונים המחייבים DNA היא החלבונים המחייבים את ה- DNA הקושרים ספציפית DNA חד גדילי. בבני אדם, חלבון השכפול A הוא החבר המובן ביותר למשפחה זו ומשמש אותו בתהליכים בהם הסליל הכפול מופרד, כולל שכפול DNA, רקומבינציה ותיקון DNA. [115] נראה שחלבונים מחייבים אלה מייצבים DNA חד גדילי ומגנים עליו מפני יצירת לולאות גזע או הידרדרות על ידי גרעינים.

    לעומת זאת, חלבונים אחרים התפתחו ונקשרו לרצפי DNA מסוימים. המחקר האינטנסיבי ביותר מבין אלה הוא גורמי התעתיק השונים, שהם חלבונים המסדירים את התעתיק. כל גורם שעתוק נקשר לקבוצה מסוימת של רצפי DNA ומפעיל או מעכב את התעתיק של גנים שיש להם רצפים אלה קרוב למקדמיהם. גורמי התעתיק עושים זאת בשתי דרכים. ראשית, הם יכולים לאגד את פולימראז ה- RNA שאחראי על שעתוק, ישירות או באמצעות חלבונים מתווכים אחרים זה מאתר את הפולימראז אצל האמרגן ומאפשר לו להתחיל בשעתוק. [117] לחלופין, גורמי שעתוק יכולים לקשור אנזימים המשנים את ההיסטונים באמרגן. זה משנה את הנגישות של תבנית ה- DNA לפולימראז. [118]

    מכיוון שמטרות DNA אלה יכולות להתרחש בכל רחבי הגנום של האורגניזם, שינויים בפעילות של גורם אחד של תמלול יכולים להשפיע על אלפי גנים. [119] כתוצאה מכך, חלבונים אלה הם לעתים קרובות המטרות של תהליכי התמרת האות השולטים בתגובות לשינויים סביבתיים או להתמיינות והתפתחות הסלולר. הספציפיות של האינטראקציות של גורמי שעתוק אלה עם DNA נובעת מהחלבונים שיוצרים מגעים רבים לקצוות בסיסי ה- DNA, ומאפשרים להם "לקרוא" את רצף ה- DNA. רוב האינטראקציות הבסיסיות האלה נעשות בחריץ העיקרי, שם הבסיסים הכי נגישים. [25]

    אנזימים המשנים DNA

    גרעינים וליגזה

    גרעינים הם אנזימים שחותכים קווצות DNA על ידי זרז הידרוליזה של קשרי הפוספודיאסטר. גרעינים המעבירים הידרוליזה של נוקלאוטידים מקצות גדילי DNA נקראים אקסונוקלאזים, ואילו אנדו -נוקליזות נחתכות בתוך קווצות. הגרעינים הנפוצים ביותר בביולוגיה המולקולרית הם אנדו -נוקליזות ההגבלה, החותכות DNA ברצפים ספציפיים. לדוגמה, האנזים EcoRV המוצג משמאל מזהה את רצף 6-הבסיס 5'-GATATC-3 'וחותך בקו האופקי. בטבע, אנזימים אלה מגנים על חיידקים מפני זיהום הפאגים על ידי עיכול ה- DNA של הפאג כאשר הוא נכנס לתא החיידקי, ופועל כחלק ממערכת שינוי ההגבלה. [121] בטכנולוגיה, הגרעינים הספציפיים לרצף אלה משמשים בשיבוט מולקולרי וטביעת אצבע DNA.

    אנזימים הנקראים ליגאזות DNA יכולים להצטרף מחדש לחוטי DNA חתוכים או שבורים. [122] ליגזות חשובות במיוחד בשכפול ה- DNA של הגדילים בפיגור, מכיוון שהן מחברות יחד את מקטעי ה- DNA הקצרים המיוצרים במזלג השכפול לעותק מלא של תבנית ה- DNA. הם משמשים גם לתיקון DNA ושילוב גנטי. [122]

    טופואיזומראסים ומסוקים

    טופואיזומראזים הם אנזימים בעלי פעילות נוקלאז וליגאז כאחד. חלבונים אלה משנים את כמות סלילי העל ב- DNA. חלק מהאנזימים הללו פועלים על ידי חיתוך סליל ה- DNA ומאפשר לסעיף אחד להסתובב, ובכך מפחית את רמת סליל העל של האנזים ואז חותם את שבירת ה- DNA. [38] סוגים אחרים של אנזימים אלה מסוגלים לחתוך סליל DNA אחד ולאחר מכן להעביר קווצת DNA נוספת דרך הפסקה זו, לפני שהם מצטרפים מחדש לסליל. [123] טופואיזומראסים נדרשים לתהליכים רבים הכוללים DNA, כגון שכפול DNA ושעתוק. [39]

    מסוקים הם חלבונים שהם סוג של מנוע מולקולרי. הם משתמשים באנרגיה הכימית בטריפוספטים של נוקלאוזיד, בעיקר אדנוזין טריפוספט (ATP), כדי לשבור קשרי מימן בין בסיסים ולפרוק את הסליל הכפול של ה- DNA לחוטים בודדים. [124] אנזימים אלה חיוניים לרוב התהליכים בהם אנזימים צריכים לגשת לבסיסי ה- DNA.

    פולימראזות

    פולימראזות הן אנזימים המסנתזים שרשראות פולינוקלאוטידים מטריפוספטים של נוקלאוזיד. רצף המוצרים שלהם נוצר על בסיס שרשראות פולינוקלאוטידים קיימות - הנקראות תבניות. אנזימים אלה מתפקדים על ידי הוספת שוב ושוב נוקלאוטיד לקבוצת ההידרוקסיל 3 'בסוף שרשרת הפולינוקלאוטידים הגדלה. כתוצאה מכך, כל הפולימראזות פועלות בכיוון 5 'עד 3'. [125] באתר הפעיל של אנזימים אלה, זוגות הבסיס הנוקלאוזיד טריפוספט הנכנסים לתבנית: זה מאפשר לפולימראז לסנתז במדויק את הגדיל המשלים של התבנית שלהם. פולימראז מסווגים לפי סוג התבנית שבה הם משתמשים.

    בשכפול דנ"א, פולימראזות תלויי דנ"א יוצרות עותקים של שרשראות פולינוקלאוטיד DNA. כדי לשמר מידע ביולוגי, חיוני שרצף הבסיסים בכל עותק ישלימו במדויק את רצף הבסיסים בגדיל התבנית. להרבה פולימראזות DNA יש פעילות הגהה. כאן, הפולימראז מזהה את הטעויות מדי פעם בתגובת הסינתזה על ידי היעדר זיווג בסיס בין הנוקלאוטידים הלא תואמים. אם מתגלה חוסר התאמה, פעילות אקסו -נוקלאז של 3 'עד 5' מופעלת והבסיס הלא נכון מוסר. [126] ברוב האורגניזמים, פולימראזות ה- DNA מתפקדות במכלול גדול שנקרא העתק המכיל יחידות משנה מרובות אביזרים, כגון מהדק ה- DNA או מסוקים. [127]

    פולימראזות תלויי RNA הן מחלקה מיוחדת של פולימראזות המעתיקות את רצף גדיל ה- RNA ל- DNA.הם כוללים טרנסקריפטאז הפוך, שהוא אנזים ויראלי המעורב בזיהום תאים על ידי רטרו -וירוסים, וטלומרז, הנדרש לשכפול טלומרים. [56] [128] לדוגמה, טרנסקריפטאז הפוך מ- HIV הוא אנזים לשכפול נגיף האיידס. [128] טלומראז הוא פולימראז יוצא דופן מכיוון שהוא מכיל תבנית RNA משלו כחלק מהמבנה שלו. הוא מסנתז טלומרים בקצות הכרומוזומים. טלומרים מונעים מיזוג של קצות הכרומוזומים השכנים ומגנים על קצות הכרומוזומים מפני נזקים. [57]

    השעתוק מתבצע על ידי פולימראז RNA תלוי DNA שמעתיק את רצף גדיל ה- DNA ל- RNA. כדי להתחיל לתמלל גן, פולימראז ה- RNA נקשר לרצף של DNA הנקרא מקדם ומפריד בין קווצות ה- DNA. לאחר מכן הוא מעתיק את רצף הגנים לתמלול RNA שליח עד שהוא מגיע לאזור DNA שנקרא הטרמינאטור, שם הוא נעצר ומתנתק מה- DNA. בדומה לפולימראזות דנ"א תלויות DNA אנושיות, RNA פולימראז II, האנזים המתעתק את רוב הגנים בגנום האנושי, פועל כחלק ממכלול חלבונים גדול עם מספר יחידות משנה רגולטוריות ואביזרים. [129]

    סליל DNA בדרך כלל אינו מתקשר עם פלחי DNA אחרים, ובתאים אנושיים, הכרומוזומים השונים אפילו תופסים אזורים נפרדים בגרעין הנקראים "שטחי כרומוזומים". ] הצלבה כרומוזומלית היא כאשר שתי סלילי DNA נשברים, מחליפים קטע ואז מצטרפים מחדש.

    רקומבינציה מאפשרת לכרומוזומים להחליף מידע גנטי ומייצרת שילובים חדשים של גנים, מה שמגדיל את יעילות הברירה הטבעית ויכול להיות חשוב בהתפתחות המהירה של חלבונים חדשים. [132] רקומבינציה גנטית יכולה להיות מעורבת גם בתיקון DNA, במיוחד בתגובת התא להפסקות של גדילים כפולים. [133]

    הצורה הנפוצה ביותר של הצלבה כרומוזומלית היא רקומבינציה הומולוגית, כאשר שני הכרומוזומים המעורבים חולקים רצפים דומים מאוד. רקומבינציה לא הומולוגית עלולה להזיק לתאים, מכיוון שהיא יכולה לייצר טרנסלוקציות כרומוזומליות וחריגות גנטיות. תגובת רקומבינציה מזרזת על ידי אנזימים המכונים רקומבינאזות, כגון RAD51. [134] השלב הראשון בשילוב מחדש הוא שבירה תקועה כפולה הנגרמת על ידי אנדו-נוקליז או פגיעה ב- DNA. [135] סדרה של צעדים המזרזים בחלקם על ידי הרקומבינאז ואז מובילה להצטרפות של שתי הסלילים על ידי צומת הולידיי אחד לפחות, בו קטע של גדיל בודד בכל סליל מתערך לגדיל המשלים בסליל השני. צומת הולידיי הוא מבנה צומת טטרהדרלי שניתן להעביר לאורך זוג הכרומוזומים, ומחליף גדיל אחד למשנהו. לאחר מכן נעצרת תגובת השילוב מחדש על ידי מחשוף של הצומת וקשירה מחדש של ה- DNA ששוחרר. [136] רק גדילים של קוטביות דומים מחליפים DNA במהלך רקומבינציה. ישנם שני סוגים של מחשוף: מחשוף מזרח-מערב ומחשוף צפון-דרום. המחשוף מצפון לדרום מכניס את שני גדילים של ה- DNA, בעוד שבמחשוף המזרח -מערב יש קווצת DNA אחת שלמה. היווצרות צומת הולידיי במהלך רקומבינציה מאפשרת גיוון גנטי, החלפת גנים בכרומוזומים וביטוי של גנום ויראלי מסוג בר.

    ה- DNA מכיל את המידע הגנטי המאפשר לכל צורות החיים לתפקד, לצמוח ולהתרבות. עם זאת, לא ברור כמה זמן בתולדות החיים של 4 מיליארד שנים DNA ביצע פונקציה זו, שכן הוצע כי צורות החיים המוקדמות ביותר עשויים להשתמש ב- RNA כחומר הגנטי שלהן. [137] [138] ייתכן שה- RNA שימש כחלק המרכזי של חילוף החומרים התא המוקדם מכיוון שהוא יכול להעביר מידע גנטי ולבצע קטליזה כחלק מהריבוזימים. [139] עולם RNA קדום זה שבו חומצה גרעין הייתה משמשת הן לקטליזה והן לגנטיקה עשויה להשפיע על התפתחות הקוד הגנטי הנוכחי המבוסס על ארבעה בסיסי נוקלאוטיד. זה יקרה, מכיוון שמספר הבסיסים השונים באורגניזם כזה הוא פשרה בין מספר קטן של בסיסים המגדילים את דיוק השכפול לבין מספר רב של בסיסים המגבירים את היעילות הקטליטי של ריבוזימים. [140] עם זאת, אין הוכחות ישירות למערכות גנטיות עתיקות, שכן התאוששות DNA מרוב המאובנים אינה אפשרית מכיוון ש- DNA שורד בסביבה פחות ממיליון שנה, ומתדרדר לאט לשברים קצרים בתמיסה. [141] הועלו טענות לדנ"א ישן יותר, ובראשן דיווח על בידוד של חיידק בר קיימא מגביש מלח בן 250 מיליון שנה, [142] אך טענות אלה שנויות במחלוקת. [143] [144]

    ייתכן שאבני בניין של DNA (אדנין, גואנין ומולקולות אורגניות קשורות) נוצרו מחוץ לכדור הארץ בחלל החיצון. [145] [146] [147] תרכובות אורגניות מורכבות של DNA ו- RNA של חיים, כולל אורציל, ציטוזין ותימין, נוצרו גם הם במעבדה בתנאים המחקים את אלה שנמצאים בחלל החיצון, באמצעות כימיקלים מתחילים, כגון פירימידין, נמצא במטאוריטים. פירימידין, בדומה לפחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAH), הכימיקל העשיר ביותר בפחמן שנמצא ביקום, עשוי להיווצר בענקים אדומים או באבק קוסמי בין עננים וגז. [148]

    בפברואר 2021 דיווחו מדענים לראשונה על רצף הדנ"א משרידי בעלי חיים, ממותה במקרה זה בן יותר ממיליון שנה, ה- DNA הוותיק ביותר שנרשם עד כה. [149] [150]

    הנדסה גנטית

    פותחו שיטות לטהר DNA מאורגניזמים, כגון מיצוי פנול-כלורופורם, ולתפעל אותו במעבדה, כגון עיכול הגבלה ותגובת שרשרת הפולימראז. הביולוגיה והביוכימיה המודרנית עושים שימוש אינטנסיבי בטכניקות אלה בטכנולוגיית DNA רקומביננטי. DNA רקומביננטי הוא רצף DNA מעשה ידי אדם שהורכב מרצפי DNA אחרים. ניתן להפוך אותם לאורגניזמים בצורה של פלסמידים או בפורמט המתאים באמצעות וקטור ויראלי. [151] ניתן להשתמש באורגניזמים מהונדסים גנטית המיוצרים לייצור מוצרים כגון חלבונים רקומביננטיים, המשמשים במחקר רפואי, [152] או לגידול בחקלאות. [153] [154]

    פרופיל DNA

    מדענים משפטיים יכולים להשתמש ב- DNA בדם, זרע, עור, רוק או שיער שנמצא בזירת פשע כדי לזהות DNA תואם של אדם, כגון עבריין. [155] תהליך זה מכונה רשמית פרופיל DNA, הנקרא גם טביעת אצבע DNA. בפרופיל DNA, משווים בין אורכי חלקים משתנים של DNA שחוזרים על עצמם, כגון חזרות טנדם קצרות ומיניסאטליות, בין אנשים. בדרך כלל שיטה זו היא טכניקה אמינה ביותר לזיהוי DNA תואם. [156] עם זאת, זיהוי יכול להיות מסובך אם המקום מזוהם ב- DNA מכמה אנשים. [157] פרופיל ה- DNA פותח בשנת 1984 על ידי הגנטיקאי הבריטי סר אלק ג'פריס, [158] ושימש לראשונה במדע פלילי כדי להרשיע את קולין פיצ'פורק בפרשת מקרי הרצח באנדרבי 1988. [159]

    התפתחות המדע הפלילי והיכולת להשיג כעת התאמה גנטית על דגימות דקות של דם, עור, רוק או שיער הובילו לבחינה מחודשת של מקרים רבים. כעת ניתן לחשוף עדויות שהיו בלתי אפשריות מבחינה מדעית בזמן הבדיקה המקורית. בשילוב עם הסרת חוק הסכנה הכפולה במקומות מסוימים, הדבר יכול לאפשר פתיחה מחודשת של מקרים בהם משפטים קודמים לא הצליחו להביא ראיות מספיקות לשכנע חבר מושבעים. אנשים המואשמים בפשעים חמורים עשויים להידרש לספק דגימת DNA למטרות התאמה. ההגנה הברורה ביותר להתאמות DNA שהושגו מבחינה משפטית היא לטעון כי התרחשה זיהום צולב של ראיות. זה הביא להליכי טיפול קפדניים עם מקרים חדשים של פשע חמור.

    פרופיל DNA משמש גם בהצלחה לזיהוי חיובי של קורבנות של נפגעים המוניים, [160] גופות או חלקי גוף בתאונות קשות, וקורבנות בודדים בקברי מלחמה המוניים, באמצעות התאמה לבני משפחה.

    פרופיל DNA משמש גם בבדיקות אבהות DNA כדי לקבוע אם מישהו הוא ההורה הביולוגי או הסבא של ילד עם סבירות להורות הוא בדרך כלל 99.99% כאשר ההורה לכאורה קשור ביולוגית לילד. שיטות רצף DNA רגילות מתרחשות לאחר הלידה, אך ישנן שיטות חדשות לבדיקת אבהות בעוד האם עדיין בהריון. [161]

    אנזימי DNA או DNA קטליטי

    Deoxyribozymes, הנקראים גם DNAzymes או DNA קטליטי, התגלו לראשונה בשנת 1994. [162] הם ברובם רצפי DNA חד גדילי המבודדים ממאגר גדול של רצפי DNA אקראיים באמצעות גישה קומבינטורית הנקראת בחירה חוץ גופית או התפתחות שיטתית של ליגנדים על ידי העשרה מעריכית. (SELEX). DNAzymes מזרזים מגוון של תגובות כימיות, כולל מחשוף RNA-DNA, קשירת RNA-DNA, חומצות אמינו זרחון-דפוספורילציה, יצירת קשרים של פחמן-פחמן וכו '. [163] המחלקה הנרחבת ביותר של DNAzymes היא סוגים של BNA המפרקים אשר שימשו לאיתור יוני מתכת שונים ועיצוב סוכנים טיפוליים. דווח על מספר אנזימי DNA ספציפיים למתכת, כולל ה- DNA-GR-5 DNAzyme (ספציפי לעופרת), [162] ה- DNA1 CA1-3 DNA (ספציפי לנחושת), [164] ה- DNAE 39E (ספציפי לאורניל) ו- DNA-NaA43 ( נתרן ספציפי). [165] האנזים NaA43, שלפי הדיווחים סלקטיבי יותר מ -10,000 פעמים עבור נתרן על פני יוני מתכת אחרים, שימש לייצור חיישן נתרן בזמן אמת בתאים.

    ביואינפורמטיקה

    ביואינפורמטיקה כוללת פיתוח טכניקות לאחסון, כריית נתונים, חיפוש ותפעול של נתונים ביולוגיים, כולל נתוני רצף חומצות גרעין DNA. אלה הובילו להתקדמות יישומית נרחבת במדעי המחשב, במיוחד אלגוריתמים לחיפוש מחרוזות, למידת מכונה ותיאוריה של מאגרי מידע. [166] אלגוריתמים לחיפוש מחרוזות או התאמה, המגלים התרחשות של רצף אותיות בתוך רצף אותיות גדול יותר, פותחו לחיפוש רצפים ספציפיים של נוקלאוטידים. [167] רצף ה- DNA עשוי להיות מיושר עם רצפי DNA אחרים כדי לזהות רצפים הומולוגיים ולאתר את המוטציות הספציפיות המייחדות אותן. טכניקות אלה, במיוחד יישור רצפים מרובים, משמשות בחקר מערכות יחסים פילוגנטיות ותפקוד חלבון. [168] מערכי נתונים המייצגים את רצף ה- DNA השלם של הגנום כולו, כגון אלה המיוצרים על ידי פרויקט הגנום האנושי, קשים לשימוש ללא ההערות המזהות את מיקומם של גנים ואלמנטים רגולטוריים על כל כרומוזום. ניתן לזהות אזורים ברצף ה- DNA שיש להם את הדפוסים האופייניים הקשורים לגנים המקודדים חלבון או RNA על ידי אלגוריתמים למציאת גנים, המאפשרים לחוקרים לחזות את נוכחותם של מוצרי גנים מסוימים ואת תפקודיהם האפשריים באורגניזם עוד לפני שהם בודדו. בניסוי. [169] ניתן גם להשוות גנום שלם, שיכול לשפוך אור על ההיסטוריה האבולוציונית של אורגניזם מסוים ולאפשר בחינת אירועים אבולוציוניים מורכבים.

    ננו -טכנולוגיה של DNA

    ננו-טכנולוגיה של DNA משתמשת במאפייני הזיהוי המולקולריים הייחודיים של DNA וחומצות גרעין אחרות ליצירת מתחמי DNA מסועפים בהרכבה עצמית עם תכונות שימושיות. [170] DNA משמש אפוא כחומר מבני ולא כנשא מידע ביולוגי. זה הוביל ליצירת סריגים תקופתיים דו ממדים (הן מבוססי אריחים והן שימוש ב- אוריגמי DNA שיטה) ומבנים תלת-ממדיים בצורות פולידרה. [171] הוכחו גם מכשירים ננו-מכניים והרכבה עצמית אלגוריתמית, [172] ומבני DNA אלה שימשו לתבנית סידור מולקולות אחרות כגון חלקיקי זהב וחלבוני סטרפטאווידין. [173]

    היסטוריה ואנתרופולוגיה

    מכיוון ש- DNA אוסף מוטציות לאורך זמן, אשר לאחר מכן עוברות בתורשה, הוא מכיל מידע היסטורי, ועל ידי השוואת רצפי DNA, גנטיקאים יכולים להסיק את ההיסטוריה האבולוציונית של האורגניזמים, פילוגנייתם. [174] תחום פילוגנטיקה זה הוא כלי רב עוצמה בביולוגיה האבולוציונית. אם משווים רצפי DNA בתוך מין, גנטיקאים אוכלוסייה יכולים ללמוד את ההיסטוריה של אוכלוסיות מסוימות. ניתן להשתמש בזה במחקרים הנעים בין גנטיקה אקולוגית לאנתרופולוגיה.

    אחסון מידע

    ל- DNA כמכשיר לאחסון מידע יש פוטנציאל עצום שכן יש לו צפיפות אחסון גבוהה בהרבה בהשוואה למכשירים אלקטרוניים. עם זאת, עלויות גבוהות, זמני קריאה וכתיבה איטיים (השהיית זיכרון) ואמינות לא מספקת מנעו את השימוש המעשי בו. [175] [176]

    הדנ"א בודד לראשונה על ידי הרופא השוויצרי פרידריך מישר, שבשנת 1869 גילה חומר מיקרוסקופי במוגלה של תחבושות כירורגיות שהושלכו. מכיוון שהוא שוכן בגרעיני התאים, הוא כינה אותו "גרעין". [177] [178] בשנת 1878, אלברכט קוסל בודד את המרכיב הלא-חלבוני של "נוקליין", חומצת גרעין, ומאוחר יותר מבודד את חמשת הגרעין הבסיסיים שלו. [179] [180]

    בשנת 1909 זיהה פואבוס לבן את יחידת הבסיס, הסוכר והפוספט של נוקלאוטיד ה- RNA (שנקראה אז "חומצת גרעין שמרים"). [181] [182] [183] ​​בשנת 1929 זיהה לוין סוכר דהוקסיריבוז ב"חומצה גרעינית תימוס "(DNA). [184] לווין הציע כי ה- DNA מורכב ממחרוזת של ארבע יחידות נוקלאוטיד המקושרות יחד דרך קבוצות הפוספט ("השערת טטרנוקלאוטיד"). לוין חשב שהשרשרת קצרה והבסיסים חוזרים על עצמם בסדר קבוע. בשנת 1927 הציע ניקולאי קולצוב שתכונות תורשתיות יירשו באמצעות "מולקולה תורשתית ענקית" המורכבת מ"שני גדילים במראה שישתכפלו בצורה שמרנית למחצה תוך שימוש בכל קווצה כתבנית ". [185] [186] בשנת 1928 גילה פרידריך גריפית 'בניסוי שלו שתכונות של הצורה ה"חלקה "של פנאומוקוק ניתן להעביר לצורה ה"מחוספסת "של אותם חיידקים על ידי ערבוב של חיידקים" חלקים "נהרגים עם הצורה" הגסה "החיה. [187] [188] מערכת זו סיפקה את ההצעה הברורה הראשונה ש- DNA נושא מידע גנטי.

    בשנת 1933, בעת חקר ביצי קיפוד ים בתולות, הציע ז'אן בראצ'ט כי DNA נמצא בגרעין התא וכי RNA קיים אך ורק בציטופלזמה. באותה תקופה חשבו ש"חומצה גרעין שמרים "(RNA) מופיעה רק בצמחים, ואילו" חומצת גרעין תימוס "(DNA) רק בבעלי חיים. האחרון נחשב כטטרמר, בעל תפקיד חוצץ pH סלולרי. [189] [190]

    בשנת 1937 ייצר ויליאם אסטבורי את דפוסי העקיפה הראשונים של רנטגן שהראו כי ל- DNA יש מבנה קבוע. [191]

    בשנת 1943, אוסוולד אייברי, יחד עם עמיתיו לעבודה קולין מקלאוד ומקלין מקארטי, זיהו את ה- DNA כעיקרון המשתנה, ותמך בהצעתו של גריפית (ניסוי אברי-מקלאוד-מקארטי). [192] בסוף 1951 החל פרנסיס קריק לעבוד עם ג'יימס ווטסון במעבדת קוונדיש באוניברסיטת קיימברידג '. תפקידו של הדנ"א בתורשה אושר בשנת 1952 כאשר אלפרד הרשי ומרתה צ'ייס בניסוי הרשי -צ'ייס הראו ש- DNA הוא החומר הגנטי של פאג אנטרובקטריה T2. [193]

    במאי 1952, ריימונד גוסלינג, סטודנט לתואר שני שעבד בהשגחת רוזלינד פרנקלין, צילם תמונת עקיפה של רנטגן, שכותרתה "תמונה 51", [194] ברמות לחות גבוהות של DNA. תמונה זו ניתנה לווטסון וקריק על ידי מוריס וילקינס והייתה קריטית להשגת המבנה הנכון של ה- DNA. פרנקלין אמר לקריק ווטסון כי עמוד השדרה חייב להיות מבחוץ. עד אז היו לינוס פאולינג ווטסון וקריק מודלים שגויים כשהשרשראות בפנים והבסיסים מופנים כלפי חוץ. הזיהוי שלה של קבוצת החלל של גבישי DNA גילה לקריק כי שני גדילים ה- DNA הם אנטי -מקבילים. [195]

    בפברואר 1953 הציעו לינוס פאולינג ורוברט קורי מודל לחומצות גרעין המכילות שלוש שרשראות שזורות זו בזו, כשהפוספטים ליד הציר, והבסיסים מבחוץ. [196] ווטסון וקריק השלימו את המודל שלהם, שמתקבל כיום כדגם הנכון הראשון של הסליל הכפול של ה- DNA. ב- 28 בפברואר 1953 קריק קטע את ארוחת הצהריים של הפטרונים בפאב הנשר בקיימברידג 'כדי להודיע ​​שהוא ווטסון "גילו את סוד החיים". [197]

    גיליון 25 באפריל 1953 של כתב העת טֶבַע פרסם סדרה של חמישה מאמרים המספקים ל- DNA ווטסון וקריק סליל כפול סליל ועדויות התומכות בו. [198] המבנה דווח במכתב שכותרתו "מבנה מולקולרי של חומצות גרעין מבנה לחומצה גרעינית Deoxyribose", שבו אמרו," לא נמנע מעינינו שהזיווג הספציפי שהנחנו מייצג באופן מיידי מנגנון העתקה אפשרי של החומר הגנטי. "[9] אחרי מכתב זה הגיע מכתב של פרנקלין וגוסלינג, שהיה הפרסום הראשון של נתוני עקיפת רנטגן משלהם ושל שיטת הניתוח המקורית שלהם. [42] [199] לאחר מכן הגיע מכתב מאת וילקינס ושניים מעמיתיו, שהכיל ניתוח של in vivo תבניות רנטגן מסוג B-DNA, ואשר תמכו בנוכחות in vivo של מבנה ווטסון וקריק. [43]

    בשנת 1962, לאחר מותו של פרנקלין, קיבלו ווטסון, קריק ווילקקינס במשותף את פרס נובל לפיזיולוגיה או לרפואה. [200] פרסי נובל מוענקים רק למקבלי חיים. ויכוח נמשך על מי צריך לקבל קרדיט על הגילוי. [201]

    במצגת משפיעה בשנת 1957, קריק הציג את הדוגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית, שניבא את הקשר בין DNA, RNA וחלבונים, וניסח את "השערת המתאם". ] [203] עבודות נוספות של קריק ועמיתיו הראו כי הקוד הגנטי התבסס על שלישיות בסיסים שאינן חופפות, הנקראות קודונים, ומאפשרות להר גובינד חוראנה, רוברט וו. הולי, ומרשל וורן נירנברג לפענח את הקוד הגנטי. [204] ממצאים אלה מייצגים את לידת הביולוגיה המולקולרית. [205]


    גנומיקה פטרייתית

    4.4 אינטרונים ניידים: יישומים וביוטכנולוגיה

    RNAs קטליטיים נחשבים שרידים לעולם ה- RNA. לכן, אינטרונים של קבוצה I וקבוצה II נחקרו באופן אינטנסיבי כמערכות מודל פוטנציאליות להבנת תגובות מחשוף RNA מסוכנות ריבוזים, שיש להן השלכות להבנת מערכות משכפלות מוקדמות בעולם ה- RNA (Landweber ואח '. 1998 Doudna ו- Cech 2002. האינטרונים מקבוצה אוטוקטלטית II נתפסים בעיני רבים כאבותיהם של האינטרונים הספליטוזומליים הגרעיניים האוקאיוטיים, ואופני השינוי שלהם מספקים מודלים פועלים לפלישת אינטרונים והתפזרים בתוך הגנום הגרעיני האוקריוטי (Pyle 2000).שעתוק הפוך מבוסס DNA הוא מנגנון ניידות המשמש את אינטרונים של קבוצה II ואלמנטים LINE. יסודות LINE הם רכיבי רטרו שיכולים להוות 10 עד 40 % מהגנום האיקריוטי. לפיכך, מחקרים ביוכימיים מפורטים על אינטרונים של קבוצה II עשויים לשפוך אור על הביולוגיה של יסודות LINE (Eickbush 1997, 1999).

    ריבוזימים הוצעו גם הן כמערכות להעברת גנים לטיפול גנטי (Guo ואח '. 2001) וכסוכנים טיפוליים שממקדים לתמלילי RNA של גנים או וירוסים המוטנטים (כימותרפיה מכוונת ריבוזים, Johansen ואח '. 1997). גו ואח '. ) עבודה פורצת דרך זו מהווה בסיס ליישומים מעשיים של "אינטרונים ממוקדי קבוצה II" בהנדסה גנטית, גנומיקה פונקציונלית וטיפול גנטי.

    מניפולציה מלאכותית של אינטרונים של קבוצה I עשויה להיות בעלת יישומים מרובים. קבוצות I ריבוזימים שונו על מנת להקטין את גודלם, אם שינו את סגוליות היעד שלהם לחבור/מחשוף ועמידותם לגרעינים גדלה. המטרה היא להשיג ריבוזימים של קבוצה I-trans-decliving שיכולים להשבית מוצרי גנים גרעיניים או ויראליים ספציפיים על ידי ביקירת mRNAs (Johansen ואח '. 1997). אנדו -נוקלאזות מקודדות של intron מקבוצה I הן אנדו -נוקלאזות חיתוכות נדירות שעשויות להיות שימושיות ככלי למיפוי הגנום הפיזי (בלפורט ואח '. 2002 ).


    האם יש ריבוזימים שחותכים גדילים כפולים - ביולוגיה

    על מנת לצפות בתוכן זה נדרשת מנוי ל- J o VE. תוכל לראות רק את 20 השניות הראשונות.

    נגן הווידאו JoVE תואם HTML5 ו- Adobe Flash. דפדפנים ישנים יותר שאינם תומכים ב- HTML5 ובקודק הווידאו H.264 עדיין ישתמשו בנגן וידאו מבוסס Flash. אנו ממליצים להוריד כאן את הגרסה החדשה ביותר של Flash, אך אנו תומכים בכל הגרסאות 10 ומעלה.

    אם זה לא עוזר, אנא יידע אותנו.

    כאשר שני גדילים של ה- DNA ניזוקו, לא נותרה תבנית שלמה לתיקון מדויק, אך אם לא תותקן, תרחיש זה יכול להוביל למוות של תאים.  

    ישנם שני מנגנונים לתיקון שבירות של גדילים כפולים. הסוג הראשון, חיבור קצה לא הומולוג, מאפשר חיבור של קצוות גם אם אין דמיון ברצף ביניהן - ומתרחש לפני שכפול DNA כאשר ה- DNA זקוק לתיקון מהיר.  

    בתאים של יונקים, הדבר מתבצע על ידי החלבון ההטרודימרי קצה ה- DNA המחייב את הקצה היוצר קומפלקס עם יחידות המשנה הקטליטיות של קינאז תלוי DNA.  

    מכלול זה מחזיק את קצות הכרומוזומים השבורים במקומם ואילו פולימראז DNA מכניס נוקלאוטידים כדי לגשר על הפער בין קצוות אלה. לאחר מכן, DNA ligase IV יוצר קומפלקס עם הקופקטור XRCC שלו וחלבון אחר הנקרא XLF, ומצטרף וחותם את הקצוות הללו.

    תיקונים מהירים כמו אלה יכולים להוביל למוטציות באתר התיקון, או לסידורים גנומיים הכוללים מחיקות, טרנסלוקציות של חומר גנטי והתמזגות אשר עלולות לגרום לכרומוזומים עם שני סנטרומרים, או לחוסר סנטרומים לחלוטין.  

    מוטציות נפוצות, ותאים סומטיים אנושיים יכולים לסבול עד 2000 כאלה. סידורים גנומיים, לעומת זאת, הם נדירים - אך ניתן למצוא אותם בתאים סרטניים.  

    רוב ההפסקות הדו-גדיליות של ה- DNA מובילות לתלויות חד-גדיליות וסוג התיקון השני, רקומבינציה הומולוגית, מתקן את ההפסקות הללו. צורה זו של רקומבינציה הרבה יותר מדויקת מהצטרפות קצה לא הומולוגית ודורשת DNA מאחות כרומטיד כתבנית, ולכן היא מתרחשת בדרך כלל לאחר שכפול הגנום במהלך חלוקת התא.

    7.6: תיקון שבירות כפולות

    למבנה הדו-גדילי של ה- DNA יש שני יתרונות עיקריים. ראשית, הוא משמש כמאגר בטוח של מידע גנטי שבו גדיל אחד משמש כגיבוי במקרה שהגדיל השני ניזוק. שנית, ניתן לעטוף את המבנה הסליל הכפול סביב חלבונים הנקראים היסטונים ליצירת נוקלאוזומים, שאפשר לפצע אותם בחוזקה ליצירת כרומוזומים. כך ניתן להכיל שרשראות DNA באורך של עד 2 סנטימטרים בתוך מבנים מיקרוסקופיים בתא. הפסקה דו-גדילית לא רק פוגעת בשני העתקי המידע הגנטי אלא גם מפריעה להמשכיות ה- DNA, מה שהופך את הכרומוזום לשברירי.

    בתא, יש הערכה של עשר הפסקות כפולות (DSB) ביום. המקור העיקרי לנזק הוא תוצרי לוואי מטבוליים כגון מינים של חמצן תגובתי וגורמים סביבתיים כגון קרינה מייננת. למרות שאנזימים גרעיניים שכיחים פחות, יכולים לגרום גם ל- DSB. כישלון של אנזימים כמו טופואיזומראזים מסוג II, החותכים את שני חוטי ה- DNA ומצטרפים אליהם תוך פירוק הכרומוזומים, יכול לגרום בטעות ל- DSB. לחץ מכני על הדופלקס ה- DNA יכול להוביל גם ל- DSBs. בפרוקריוטים, התייבשות ממושכת מאמצת את ה- DNA וגורמת ל- DSB.

    מבין שני המנגנונים לתיקון ה- DNA, רקומבינציה הומולוגית תלויה בכרומטיד אחות שנמצא בקרבת מקום, מה שקורה בשלבי S ו- G2. בשל מגבלה זו, בהעדר תורם הומולוגיה, התאים צריכים לפנות להצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), למרות שהיא הרבה פחות מדויקת. ההשערה היא שהסיבה לכך שאאוקריוטים גבוהים יותר יכולים להרשות לעצמם לנצל NHEJ באופן עדיף לתיקוני DSB היא שיש להם שפע של DNA שאינו מקודד, מה שמאפשר החלפות נוקלאוטיד, מחיקות או תוספות ללא השלכות חמורות.


    היסטוריה של מחקר ה- DNA

    הדנ"א בודד לראשונה על ידי הרופא השוויצרי פרידריך מישר, שבשנת 1869 גילה חומר מיקרוסקופי במוגלה של תחבושות כירורגיות שהושלכו. מכיוון שהוא שוכן בגרעיני התאים, הוא כינה אותו "גרעין". [161] בשנת 1878, אלברכט קוסל בודד את המרכיב הלא-חלבוני של "נוקליין", חומצת גרעין, ומאוחר יותר מבודד את חמשת הנוקלאובאזים העיקריים שלו. [162] בשנת 1919 זיהה פואבוס לבן את יחידת הבסיס, הסוכר והפוספט הנוקלאוטיד. [163] לווין הציע ש- DNA מורכב משורה של יחידות נוקלאוטיד המקושרות יחד דרך קבוצות הפוספטים. עם זאת, לבן חשב שהשרשרת קצרה והבסיסים חוזרים על עצמם בסדר קבוע. בשנת 1937 ייצר ויליאם אסטבורי את דפוסי העקיפה הראשונים של רנטגן שהראו כי ל- DNA יש מבנה קבוע. [164]

    בשנת 1927 הציע ניקולאי קולצוב שתכונות תורשתיות יירשו באמצעות "מולקולה תורשתית ענקית" המורכבת מ"שני גדילים במראה שישתכפלו בצורה שמרנית למחצה תוך שימוש בכל קווצה כתבנית ". [165] בשנת 1928 גילה פרידריך גריפית כי תכונות של הצורה ה"חלקה "של פנאומוקוק ניתן להעביר לצורה ה"מחוספסת "של אותם חיידקים על ידי ערבוב של חיידקים" חלקים "נהרגים עם הצורה" הגסה "החיה. [166] מערכת זו סיפקה את ההצעה הברורה הראשונה לכך ש- DNA נושא מידע גנטי - הניסוי של אברי – מקלאוד – מקארטי - כאשר אוסוולד אייברי, יחד עם עמיתיו לעבודה קולין מקלאוד ומקלין מקארטי, זיהו את ה- DNA כעיקרון המתרחש בשנת 1943. [167] ה- DNA של תפקיד התורשה אושר בשנת 1952, כאשר אלפרד הרשיי ומרתה צ'ייס בניסוי הרשי -צ'ייס הראו ש- DNA הוא החומר הגנטי של הפאג 'T2. [168]

    בשנת 1953 הציעו ג'יימס ווטסון ופרנסיס קריק את מה שמקובל כיום כמודל הסליל הכפול הראשון הנכון של מבנה ה- DNA בכתב העת. טֶבַע. [5] מודל ה- DNA המולקולרי הכפול של הסליל שלהם התבסס אז על תמונת עקיפה בודדת של רנטגן (שכותרתה "תמונה 51") [169] שצולמו על ידי רוזלינד פרנקלין וריימונד גוסלינג במאי 1952, כמו גם המידע כי בסיסי ה- DNA משויכים - מתקבלים גם באמצעות תקשורת פרטית מאת ארווין צ'רגף בשנים הקודמות. חוקי צ'רג'ף מילאו תפקיד חשוב מאוד בהקמת תצורות סליל כפול עבור B-DNA וגם A-DNA.

    עדויות ניסיוניות התומכות במודל ווטסון וקריק פורסמו בסדרה של חמישה מאמרים באותו גיליון שלטֶבַע. [170] מתוכם, המאמר של פרנקלין וגוסלינג היה הפרסום הראשון של נתוני עקיפת רנטגן ושיטת ניתוח מקורית שתמכו באופן חלקי במודל ווטסון וקריק [41] [171] גיליון זה הכיל גם מאמר על מבנה ה- DNA על ידי מוריס וילקינס ושניים מעמיתיו, שהניתוח שלהם in vivo דפוסי רנטגן מסוג B-DNA תמכו גם בנוכחות in vivo של תצורות ה- DNA הסליל הכפול כפי שהציעו קריק ווטסון עבור המודל המולקולרי הכפול שלה של ה- DNA בשני העמודים הקודמים שלטֶבַע. [42] בשנת 1962, לאחר מותו של פרנקלין, קיבלו ווטסון, קריק ווילקקינס במשותף את פרס נובל לפיזיולוגיה או לרפואה. [172] פרסי נובל הוענקו רק לזוכים החיים באותה תקופה. ויכוח נמשך על מי צריך לקבל קרדיט על הגילוי. [173]

    במצגת משפיעה בשנת 1957, קריק הציג את הדוגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית, שניבא את הקשר בין DNA, RNA וחלבונים, וניסח את "השערת המתאם". [174] אישור סופי של מנגנון השכפול שהשתמשה במבנה הסליל הכפול בעקבותיו בשנת 1958 באמצעות ניסוי מסלסון-שטאל. [175] עבודות נוספות של קריק ועמיתיו הראו שהקוד הגנטי מבוסס על שלישיות בסיסים שאינן חופפות, הנקראות קודונים, ומאפשרות להר גובינד חוראנה, רוברט וו. הולי ומרשל וורן נירנברג לפענח את הקוד הגנטי. [176] ממצאים אלה מייצגים את לידת הביולוגיה המולקולרית.


    צפו בסרטון: האם תצליחו לפתור את החידה? - הפרדוקס של מונטי הול (יָנוּאָר 2022).